三七根腐病致病菌轮枝镰刀菌的Real-timePCR检测引物及方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN109439791A(43)申请公布日2019.03.08(21)申请号201811517612.2(22)申请日2018.12.12(71)申请人昆明理工大学地址650093云南省昆明市五华区学府路253号(72)发明人刘迪秋李欣崔秀明邱炳玲张应鹏李珊(51)Int.Cl.C12Q1/6895(2018.01)C12Q1/686(2018.01)C12Q1/04(2006.01)C12N15/11(2006.01)C12R1/77(2006.01)权利要求书1页说明书7页序列表1页附图2页(54)发明名称三七根腐病致病菌轮枝镰刀菌的Real-timePCR检测引物及方法(57)摘要本发明公开了一种三七根腐病致病菌轮枝镰刀菌的Real-timePCR检测引物及方法，检测引物的核苷酸序列为：上游引物Fv-QF:5’GTCAGCGTTCTTATTACGGATGC3’，下游引物Fv-QR:5’TGTTGGAGGTAGTTACCCTATGTTCA3’；本发明设计轮枝镰刀菌的特异性引物，建立标准曲线用于轮枝镰刀菌的定性定量分子检测和病害准确诊断；利用本发明能快速准确检测三七种植土壤以及三七病株中轮枝镰刀菌的数量动态变化，因而可以为三七土壤处理、根腐病的早期诊断和动态监测以及三七种子、种苗的带菌分子检测提供技术支持。CN109439791ACN109439791A权利要求书1/1页1.一种三七根腐病致病菌轮枝镰刀菌的Real-timePCR检测引物，其特征在于，引物的核苷酸序列为：上游引物Fv-QF:5’GTCAGCGTTCTTATTACGGATGC3’下游引物Fv-QR:5’TGTTGGAGGTAGTTACCCTATGTTCA3’。2.利用权利要求1所述检测引物的三七根腐病致病菌轮枝镰刀菌的检测方法，其特征在于包括以下步骤：（1）提取三七样品或土壤的DNA；（2）以提取DNA为模板进行实时荧光定量PCR扩增，扩增程序为95℃2min，然后进行45个循环反应，每个循环反应为95℃1min，62℃30s，72℃1min，于72℃时测定荧光值，每个循环结束后收集并记录荧光信号；（3）实时荧光定量PCR标准曲线的建立制备浓度在0.004ng/μL～40ng/μL范围内的重组质粒pGEM-T-FvBlh溶液，对不同浓度的溶液进行实时荧光定量PCR反应，扩增程序同步骤（2），于72℃时测定荧光值，每个循环反应结束后收集并记录荧光信号，以各梯度浓度对应的质粒质量对数值作为纵坐标，Ct值为横坐标，得到线性回归方程，并建立标准曲线；（4）若出现荧光信号则可判定所检测样品中存在根腐病致病菌轮枝镰刀菌，并将获得的Ct值带入构建的标准曲线中，计算得到检测样品中轮枝镰刀菌的数量。3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于：实时荧光定量PCR的反应体系为20μL，其包含2×SYBRGreenMix10μL、无核酸酶水7μL、上游引物Fv-QF1μL，下游引物Fv-QR1μL、DNA模板1μL。4.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于：上游引物Fv-QF和下游引物Fv-QR的浓度均为2μmol/L。2CN109439791A说明书1/7页三七根腐病致病菌轮枝镰刀菌的Real-timePCR检测引物及方法技术领域[0001]本发明涉及一种三七根腐病致病菌轮枝镰刀菌的Real-timePCR检测引物及其检测方法，专用于三七根腐病菌的快速分子检测，同时可实现田间三七根腐病菌的早期诊断和病菌的监测鉴定，属于农作物病害的分子生物学检测技术领域。背景技术[0002]三七[Panaxnotoginseng(Burk)F.H.Chen)]为五加科(Araliaceae)人参属(Panax)植物，其干燥根及根茎入药，是我国传统名贵中药材；其味甘、微苦、性温，归肝、胃、大肠经，具有化瘀止血、消肿止痛等作用。研究表明其主要成分有三萜类化合物甾醇类、人参炔三醇、黄酮类、糖类、微量元素和氨基酸等(DaweiL,JiaqingC,XiuliB,etal.Newdammarane-typetriterpenoidsfromtheleavesofPanaxnotoginsengandtheirproteintyrosinephosphatase1Binhibitoryactivity.JournalofGinsengResearch,2014,38(1):28-33)。其中，三七总皂苷为其主要的药用活性成分，在三七中含量约为12%（郑丽华,卢昌均,周志昆.HPLC测定三七总皂苷中5种皂苷的含量及稳定性考察.中医药临床杂志,2012,24(1):73-75)。三七皂苷是治疗心血管疾病的活性成分，也是目前研究较为系统的