用于检测苹果牛眼果腐病致病菌的LAMP引物组及其应用.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN104630376A(43)申请公布日2015.05.20(21)申请号201510088767.9(22)申请日2015.02.26(71)申请人李鑫地址116001辽宁省大连市中山区长江东路60号申请人李立梅张晓军曹冬梅(72)发明人李鑫李立梅张晓军曹冬梅(74)专利代理机构大连格智知识产权代理有限公司21238代理人刘晓琴(51)Int.Cl.C12Q1/68(2006.01)C12Q1/04(2006.01)C12N15/11(2006.01)C12R1/645(2006.01)权利要求书1页说明书5页序列表3页附图3页(54)发明名称用于检测苹果牛眼果腐病致病菌的LAMP引物组及其应用(57)摘要用于检测苹果牛眼果腐病致病菌的LAMP引物组及其应用，所述的引物组，包括由SEQIDNo.1～4编码的四条引物。本研究建立的LAMP检测苹果牛眼果腐病菌的引物组及相关检测技术，具有灵敏度高、特异性强、耗时短、操作简单、鉴定简便等优点。简化整个植物检疫过程，缩短检测时间，提高检测效率，创造更好的检验检疫环境。CN104630376ACN104630376A权利要求书1/1页1.用于检测苹果牛眼果腐病致病菌的LAMP引物组，其特征在于，包括由SEQIDNo.1～4编码的四条引物：F3：5’-ACGGATCTCTTGGTTCTGG-3’[SEQIDNo.1]B3：5’-TTACTACGCTTAGAGCCAGA-3’[SEQIDNo.2]FIP：5’-GCGCAATGTGCGTTCAAAGATT-GAACGCAGCGAAATGCGATA-3’[SEQIDNo.3]BIP：5’-TGTTCGAGCGTCATTACAACCC-CGCCACTGATTTTAGGGC-3’[SEQIDNo.4]。2.根据权利要求1所述的引物组，其特征在于所述的苹果牛眼果腐病致病菌为明孢盘菌属致病菌，包括：Neofabreaeperennans，Neofabreaemalicorticis和Neofabreaealba。3.用于检测苹果牛眼果腐病致病菌的LAMP试剂盒，包括权利要求1所述的引物组。4.基于LAMP的苹果牛眼果腐病致病菌检测方法，包括如下步骤：a.提取待测样品DNA；b.以权利要求1所述的引物组为引物，以步骤a所提取的DNA为模板进行LAMP扩增；c.扩增产物分析及结果判断。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的步骤b中LAMP扩增条件为：65℃恒温30～60min；80℃恒温5min或在95℃下恒温2min；终止反应。6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的步骤b中LAMP扩增反应体系各引物浓度为：F3，0.2umol/L；B3，0.2umol/L；FIP，1.6umol/L；BIP，1.6umol/L。7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的步骤b中LAMP扩增反应体系的待测样品DNA浓度为1.6ng/μL。8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的步骤a所制备的DNA样品的OD260/OD280为1.7～2.0。2CN104630376A说明书1/5页用于检测苹果牛眼果腐病致病菌的LAMP引物组及其应用技术领域[0001]本发明涉及微生物检测技术，尤其涉及基于LAMP技术的植物病菌的快速检测。背景技术[0002]苹果牛眼果腐病是由明孢盘菌属真菌(Neofabraeaalba、N.perennans、N.malicorticis和Neofabraeaundescribedspecies)引起的,被中国列为禁止入境的检疫性真菌病害。该病菌的寄主植物包括苹果、梨在内的多种蔷薇科果树。根据症状特点和病菌形态特征很难鉴定。对苹果牛眼果腐病菌的鉴定，目前只有采用常规PCR和测序手段同时进行判定，虽然准确率较高，但整个检测周期最少在10天左右，有时甚至长达20天，而根据《进出境动植物检疫法》规定，进境货物在实验室出具检验检疫结果之前，该批货物不得销售、使用，因此较长的检测周期，严重影响了货物的通关速度，甚至会给货主带来了不必要的经济损失。[0003]苹果牛眼果腐病主要依靠进境水果传播蔓延，辽宁口岸是水果进境的重要口岸，业务量位居全国第二，进境水果中苹果牛眼果腐病菌的检疫鉴定工作是阻止其传入我国的重中之重。LAMP法是近年来发展迅速的一种快速检测方法，其较与PCR最大的优势在于，检测时间大大缩短，检测结果肉眼可见，检测特异性提高两个数量及，且扩增阶段对仪器的要求低，不需要检测仪。[0004]此方法的研发能减少真菌的鉴定时间，使用方便，可推广应用于检测一线本研究首次将LAMP方法应用于检疫性植物真菌鉴定中，旨于开发出更高效、准确的检测方法，以应用推广