三七根腐病致病菌茄腐镰刀菌的Real-timePCR检测引物及方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN109468401A(43)申请公布日2019.03.15(21)申请号201811516522.1(22)申请日2018.12.12(71)申请人昆明理工大学地址650093云南省昆明市五华区学府路253号(72)发明人刘迪秋李欣张应鹏邱炳玲李珊(51)Int.Cl.C12Q1/6895(2018.01)C12Q1/04(2006.01)C12Q1/6851(2018.01)C12N15/11(2006.01)C12R1/77(2006.01)权利要求书1页说明书7页序列表1页附图2页(54)发明名称三七根腐病致病菌茄腐镰刀菌的Real-timePCR检测引物及方法(57)摘要本发明公开了一种三七根腐病致病菌茄腐镰刀菌的Real-timePCR检测引物及方法，检测引物的核苷酸序列为上游引物Fs-QF:5’CCACGCTTGTGAGCTATGTAGTTC3’；下游引物Fs-QR:5’CTCTTGAGGTAGACCACAGTAGGC3’；本发明设计茄腐镰刀菌的特异性引物，建立标准曲线用于茄腐镰刀菌的定性定量分子检测和病害准确诊断；利用本发明能明确复杂三七种植土壤以及三七病株中茄腐镰刀菌的数量动态变化，因而可以为三七土壤处理、根腐病的早期诊断和动态监测以及带病三七种子、种苗的分子检测提供技术支持。CN109468401ACN109468401A权利要求书1/1页1.一种三七根腐病致病菌茄腐镰刀菌的Real-timePCR检测引物，其特征在于，引物的核苷酸序列为：上游引物Fs-QF:5’CCACGCTTGTGAGCTATGTAGTTC3’；下游引物Fs-QR:5’CTCTTGAGGTAGACCACAGTAGGC3’。2.利用权利要求1所述检测引物的三七根腐病致病菌茄腐镰刀菌的Real-timePCR检测方法，其特征在于包括以下步骤：(1)提取三七检测样品或土壤的DNA；(2)以提取的DNA为模板进行荧光定量PCR扩增，扩增程序为95℃2min，然后进行45个循环反应，每个循环反应为95℃1min，62℃30s，72℃1min，于72℃时测定荧光值；每个循环结束后自动收集并记录荧光信号；(3)实时荧光定量PCR标准曲线的建立制备浓度在0.0002ng/μL～20ng/μL范围内的重组质粒pGEM-T-CYP505溶液，对不同浓度的溶液进行实时荧光定量PCR反应，扩增程序同步骤（2），于72℃时测定荧光值，每个循环反应结束后收集并记录荧光信号，以各梯度浓度对应的质粒质量对数值作为纵坐标，Ct值为横坐标，得到线性回归方程，并建立标准曲线；(4)若有荧光信号则可判定所检测样品中存在根腐病致病菌茄腐镰刀菌，将上步所得的Ct值带入本发明构建的标准曲线中，计算得到检测样品中茄腐镰刀菌的数量。3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于：实时荧光定量PCR的反应体系为20μL，包含2×SYBRGreenMix10μL、无核酸酶水7μL、上游引物Fs-QF1μL、下游引物Fs-QR-QR1μL、DNA模板1μL。4.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于：上游引物Fs-QF和下游引物Fs-QR-QR浓度均为2μmol/L。2CN109468401A说明书1/7页三七根腐病致病菌茄腐镰刀菌的Real-timePCR检测引物及方法技术领域[0001]本发明涉及一种三七根腐病致病菌茄腐镰刀菌的Real-timePCR检测引物及其检测方法，专用于三七根腐病菌茄腐镰刀菌的快速分子检测，实现田间三七根腐病的早期诊断和病菌数量的动态监测，同时可用于土壤、三七种子及其种苗中根腐病菌数量的检测，属于植物病害的分子检测及诊断领域。背景技术[0002]三七[Panaxnotoginseng(Burk)F.H.Chen]为五加科(Araliaceae)人参属(Panax)多年生草本植物，别名山漆、金不换、血参、人参三七、佛手三漆、参三七、田七、滇三七、盘龙七。因其播种后三至七年方可采挖入药，而且每株长三个叶柄，每个叶柄生七个叶片，故名三七。三七根、根茎、叶、花均可入药，以根和根茎为主。三七使用历史近600年，栽培历史近500年，常在春冬两季采挖，分为“春七”和“冬七”。三七是中药材中的一颗明珠，清朝药学著作《本草纲目拾遗》中记载：“人参补气第一，三七补血第一，味同而功亦等，故称人参三七，为中药中之最珍贵者。”扬名中外的中成药“云南白药”和“片仔癀”，即以三七为主要原料制成。[0003]三七、人参与西洋参是人参家族的主要成员。其中，三七的药效成分含量最高，主要成分有三七素（田七氨酸）、三七总皂苷（Panaxnotoginsengsaponins，PNS）、黄酮、挥发油、氨基酸、糖类、微量元素(张静