一种重组酿酒酵母工程菌株及其应用.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局*CN102220254A*(12)发明专利申请(10)申请公布号CN102220254A(43)申请公布日2011.10.19(21)申请号201010148471.9(22)申请日2010.04.14(71)申请人新疆农业科学院生物质能源研究所地址830091新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市南昌路403号(72)发明人叶凯刘敏涂振东(74)专利代理机构北京路浩知识产权代理有限公司11002代理人王朋飞张庆敏(51)Int.Cl.C12N1/19(2006.01)C12N15/81(2006.01)C12P7/10(2006.01)C12R1/865(2006.01)权利要求书1页说明书6页序列表3页附图1页(54)发明名称一种重组酿酒酵母工程菌株及其应用(57)摘要本发明公开了一种重组酿酒酵母工程菌株，从毕赤酵母(Pichiapastoris)GS115中克隆GAP基因片段，更换PYES2载体的诱导性启动子为组成型GAP启动子，然后将木糖还原酶基因xyl1片段和木糖醇脱氢酶基因xyl2片段串联在一起，导入含组成型GAP的PYES2载体中，构建PYES2-GAP-xyl1-xyl2质粒，将该质粒导入酿酒酵母中。本发明的工程菌能共表达木糖还原酶和木糖醇脱氢酶，活性高，木糖还原酶和木糖醇脱氢酶的表达量高。能高效利用秸秆中纤维素和半纤维素降解的五碳糖和六碳糖，从而提高燃料乙醇的产量，降低生产成本，减少环境污染。可用于发酵生产燃料乙醇。CN10254ACCNN110222025402220263A权利要求书1/1页1.一种重组酿酒酵母工程菌株，其特征在于，从毕赤酵母(Pichiapastoris)GS115中克隆GAP基因片段，更换PYES2载体的诱导性启动子为组成型GAP启动子，然后将木糖还原酶基因xyl1片段和木糖醇脱氢酶基因xyl2片段串联在一起，导入含组成型GAP的PYES2载体中，构建PYES2-GAP-xyl1-xyl2质粒，将该质粒导入酿酒酵母中。2.如权利要求1所述的重组酿酒酵母工程菌株，其特征在于，所述菌株为：INVSc1/GAP1-(GAP1-xyl2-CYC1)-(GAP1-xyl1-CYC1)-CYC1或INVSc1/GAP1-(GAP1-xyl1-CYC1)-(GAP1-xyl2-CYC1)-CYC1，其能共表达木糖还原酶和木糖醇脱氢酶。3.权利要求1或2所述的工程菌株在利用秸秆发酵生产燃料乙醇中的应用。2CCNN110222025402220263A说明书1/6页一种重组酿酒酵母工程菌株及其应用技术领域[0001]本发明涉及基因工程菌的构建，特别是涉及一种重组酿酒酵母工程菌株及其应用。背景技术[0002]随着能源需求的剧增和化石燃料短缺的加剧，研究石油的替代燃料已经成为一个迫在眉睫的世界性课题。燃料酒精是一种公认的清洁便捷的可再生生物能源，在可再生资源中是最有发展潜力的液体燃料，是未来可持续发展的“绿色油田”。生产燃料酒精越来越受到人们的重视，传统酒精由淀粉质原料发酵而成，而利用木质纤维素原料(如秸秆)生产燃料酒精的成本更低，能减少燃烧的挥发损失，缓解环境压力、能源危机和粮食危机，具有可观的经济效益和绿色环保的社会效益。[0003]我国是一个幅员广阔的农业大国，仅农作物秸秆年产量高达7亿多吨，相当于3.5亿吨的标准煤，但是当前大量的秸秆资源主要作为灶炕直接燃烧及低附加值利用，转化效率非常低下，不但没有得到有效利用，反而排放大量有害气体污染环境。因此，以秸秆为原料，使来自农林业废弃物变废为宝，开发利用秸秆生产燃料乙醇对于改善大气环境质量和实现我国能源安全战略具有重要的现实意义。[0004]秸秆属于木质纤维素，主要由纤维素、半纤维素和木质素组成(4∶3∶3)，其中纤维素水解得到葡萄糖，微生物能够直接利用，而含量仅次于纤维素的半纤维素的水解产物中，主要成分是葡萄糖和D-木糖，木糖含量稍次。秸秆中半纤维素的含量占其干重25％-50％，其主要分解产物也是木糖。将秸秆中D-木糖和六碳糖进行生物转化产生酒精，具有非常重要的经济意义。[0005]木糖还原酶(Xylosereductase，XR)的重要性不仅体现在它能够催化木糖生成木糖醇，更重要的是它能利用木糖发酵生产燃料酒精，是木糖代谢途径中的关键酶之一。木糖发酵是生物转化木质纤维素产生酒精最为重要的一环，木糖的乙醇发酵是植物纤维原料生物转化生产乙醇的关键因素。研究显示，适宜的木糖发酵产率及乙醇浓度能够降低工艺总成本的25％，因此提高乙醇发酵产率是燃料酒精工业化生产的必要条件。[0006]自然界中木糖的代谢途径有两条：一是在某些细菌中，其木糖异构酶(Xyloseisomerase，XI)能够将木糖转化为木酮糖；二是在某些真菌中，如酵母菌和丝