非编码RNA用于细胞培养和选择的方法及组合物.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN107429248A(43)申请公布日2017.12.01(21)申请号201580065756.7(74)专利代理机构北京泛诚知识产权代理有限(22)申请日2015.10.03公司11298代理人杨本良文琦(30)优先权数据62/059,5732014.10.03US(51)Int.Cl.C12N15/11(2006.01)(85)PCT国际申请进入国家阶段日C12N5/10(2006.01)2017.06.02C12N15/85(2006.01)(86)PCT国际申请的申请数据PCT/US2015/0538972015.10.03(87)PCT国际申请的公布数据WO2016/054616EN2016.04.07(71)申请人霍库斯勒库斯有限责任公司地址美国纽约州申请人维也纳农业大学(72)发明人爱德华·埃弗利思尼科尔·波尔斯权利要求书2页说明书11页附图5页(54)发明名称非编码RNA用于细胞培养和选择的方法及组合物(57)摘要本文描述的是用于生产目的基因(GOI)的方法和组合物，其在某些实施例中能够相比于现有技术方法减少细胞的代谢负担并且减少GOI生产与标志物生产的去关联。所述方法涉及正向选择和负向选择途径以建立GOI高产细胞系，例如CHO系。在某些实施例中，所述方法包括用(a)包括GOI和非编码RNA的寡核苷酸、和(b)编码选择蛋白的寡核苷酸来转染细胞；其中非编码RNA促进或抑制选择蛋白的生产。产生GOI的细胞能够作为选择蛋白的存在或缺失的检测结果或者通过检测选择蛋白的存在或缺失而确定或选择。CN107429248ACN107429248A权利要求书1/2页1.一种用于识别生产目的基因(GOI)的细胞的方法，该方法包括：(1)利用(a)包括所述GOI和一个以上非编码RNA的寡核苷酸，以及(b)编码选择蛋白的寡核苷酸转染所述细胞；其中所述一个以上非编码RNA促进或抑制所述选择蛋白的生产；并且(2)作为所述选择蛋白的缺失或存在的检测结果或者通过检测所述选择蛋白的缺失或存在而识别或者选择生产所述GOI的细胞。2.如权利要求1所述的方法，其中所述一个以上非编码RNA促进细胞存活和/或提高每细胞生产的GOI的量。3.如权利要求1或2所述的方法，其中所述一个以上非编码RNA是ebv-miR-BART10-3p或者mirR-7。4.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述编码选择蛋白的寡核苷酸还包括能够由所述一个以上非编码RNA稳定的sxRNA，从而促进所述选择蛋白的翻译。5.如权利要求4所述的方法，其中所述方法还包括利用第二选择蛋白转染所述细胞，其中所述第二选择蛋白是死亡基因并且其中所述一个以上非编码RNA抑制所述死亡基因的生产。6.如权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述一个以上非编码RNA是能够与所述编码选择蛋白的寡核苷酸结合并抑制所述编码选择蛋白的寡核苷酸的miRNA或者siRNA。7.如权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或者人胚肾(HEK)细胞。8.如权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述选择蛋白是抗生素抗性基因、荧光标记物、细胞表面标记物、或者细胞死亡基因。9.如权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述一个以上非编码RNA编码在所述GOI的内含子中。10.如权利要求1至9中任一项所述的方法，进一步包括利用第二GOI和第二非编码RNA转染所述细胞，其中所述第二GOI和所述第二非编码RNA位于同一寡核苷酸上。11.如权利要求10所述的方法，其中所述第二非编码RNA编码在所述第二GOI的内含子中。12.如权利要求10或11所述的方法，其中所述第一非编码RNA和所述第二非编码RNA是相同的。13.如权利要求10或11所述的方法，其中(1)所述第一非编码RNA和所述第二非编码RNA是不同的并且其中(2)所述编码选择蛋白的寡核苷酸还编码第二选择蛋白，或者其中所述方法包括利用编码第二选择蛋白的第二寡核苷酸转染所述细胞，其中(2)所述第二非编码RNA促进或者抑制所述第二选择蛋白的翻译。14.一种促进生产目的基因(GOI)的细胞的存活的方法，所述方法包括：利用(a)包括GOI和一个以上siRNA的寡核苷酸，以及(b)编码对细胞致命的蛋白的寡核苷酸来转染细胞；其中所述一个以上siRNA能够抑制致命蛋白的生产，从而促进生产所述2CN107429248A权利要求书2/2页GOI的所述细胞的存活。15.一种转基因细胞，其包括：(a)包括目的基因(GOI)和一个以上非编码RNA的寡核苷酸，以及(b)编码选择蛋白的寡核苷酸；其中所述非编码RNA促进或抑制所述选择蛋白的翻译。16.如权利要求15所述的细胞，其中所述编码选择