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(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN109738638A(43)申请公布日2019.05.10(21)申请号201910004522.1(22)申请日2019.01.03(71)申请人西北农林科技大学地址712100陕西省西安市杨凌示范区邰城路3号(72)发明人王建龙王宗汉张道宏张文涛姚晓琳窦磊娜赵兵欣(74)专利代理机构西安恒泰知识产权代理事务所61216代理人孙雅静(51)Int.Cl.G01N33/569(2006.01)G01N33/558(2006.01)G01N33/544(2006.01)权利要求书1页说明书8页附图3页(54)发明名称直接免疫层析检测方法、试纸条及检测大肠杆菌的应用(57)摘要本发明公开了直接免疫层析检测方法、试纸条及检测大肠杆菌的应用,基于革兰氏染色原理,结晶紫先将细菌染为蓝紫色,然后由于毛细管作用,被染色的细菌沿着硝酸纤维素膜迁移,基于抗原抗体特异性结合原理,被T线的抗体捕获,使T线显示可见的强烈的蓝紫色。只需将细菌进行简单的染色就可得到明亮的蓝紫色,而不使用任何纳米材料标记抗体,免去了复杂的标记过程。该发明只用一种抗体划在硝酸纤维素膜上直接进行检测,打破了传统同时采用两种抗体的夹心检测方法,大大节省了成本,解决了配对抗体的困难,更简单、方便、新颖。CN109738638ACN109738638A权利要求书1/1页1.一种直接免疫层析检测方法,其特征在于,包括用结晶紫将待检测样品中的大肠杆菌进行染色得到待检液,再通过大肠杆菌单克隆抗体捕获待检液中的染色后的大肠杆菌;所述的结晶紫为结晶紫溶液,结晶紫溶液的质量百分浓度为0.01%~0.03%,大肠杆菌单克隆抗体的用量为1~1.5mg/mL。2.如权利要求1所述的直接免疫层析检测方法,其特征在于,结晶紫将待检测样品中的大肠杆菌进行染色的染色时间至少为1分钟,大肠杆菌单克隆抗体捕获待检液中的染色后的大肠杆菌的捕获时间为10~15分钟。3.一种直接免疫层析检测方法的试纸条,其特征在于,该试纸条采用权利要求1或2所述的大肠杆菌的检测方法进行检测。4.如权利要求3所述的直接免疫层析检测方法的试纸条,其特征在于,所述试纸条的检测线包被有大肠杆菌单克隆抗体,试纸条无质控线。5.如权利要求3所述的直接免疫层析检测方法的试纸条,其特征在于,所述的试纸条包括衬板,衬板上贴有硝酸纤维素膜,硝酸纤维素膜的一端覆盖吸水垫,硝酸纤维素膜的另一端依次覆盖样品垫和结合垫,硝酸纤维素膜的非覆盖面上沿横向设置检测线;检测线包被有大肠杆菌单克隆抗体,结合垫及样品垫分别经封闭液封闭处理。6.如权利要求4或5所述的直接免疫层析检测方法的试纸条,其特征在于,检测线包被有大肠杆菌单克隆抗体的制备方法包括:大肠杆菌单克隆抗体溶于包被液配制成1mg/mL的抗体包被溶液,将抗体包被溶液以1μL/cm的速度包被于距硝酸纤维素膜的检测线上。7.如权利要求6所述的直接免疫层析检测方法的试纸条,其特征在于,所述的包被液为:0.02g叠氮化钠、0.8g氯化钠、0.29g十二水磷酸氢二钠、0.02g氯化钾和磷酸二氢钾0.02g加水定容至100mL即得。8.权利要求1-2所述的直接免疫层析检测方法用于检测饮用水中大肠杆菌的应用。9.权利要求3-7所述的直接免疫层析检测方法的试纸条用于检测饮用水中大肠杆菌的应用。2CN109738638A说明书1/8页直接免疫层析检测方法、试纸条及检测大肠杆菌的应用技术领域[0001]本发明属生物检测领域,具体涉及直接免疫层析检测方法、试纸条及检测大肠杆菌的应用。背景技术[0002]食源性致病菌的污染是食品安全的主要威胁之一。在食源性病原体中,大肠杆菌是一种危害性极大的致病菌,每年有数百万人深受其害。大肠杆菌是一类大小为1-3μm,周生鞭毛,能发酵多种糖类产酸、产气,无芽孢的革兰氏阴性菌。根据菌体抗原(O抗原),鞭毛抗原(H抗原)和表面抗原(K抗原),大肠杆菌可以分为150多种血清型。作为哺乳动物肠道的正常栖息菌,绝大多数大肠杆菌是不致病的,但有16个血清型除外。其中,肠出血性大肠杆菌是一类重要的食源性致病菌,一旦被人类摄入肠道,会粘附在小肠和结肠,造成肠粘膜水肿、出血,同时产生类志贺毒素,使人体产生痉挛性腹痛、出血性腹泻等症状,也是临床上出血性肠炎和溶血性尿毒症的主要原因。[0003]免疫层析技术是一种将免疫技术和色谱层析技术合二为一并且集中了二者的优点的免疫分析方法,此方法快速、灵敏,发展于上世纪八十年代。免疫层析试纸检测技术是基于免疫学抗原抗体的特异性反应及层析原理建立起来的。典型的免疫试纸分为四个部分:样品垫、结合垫、检测膜和吸收垫(也有试纸只有样品垫,检测膜和吸收垫组成),样品垫与结合垫多为玻璃纤维棉组成、检测膜多为硝酸纤维素