一种鉴别羊痘病毒和牛结节性皮肤病病毒的双重荧光PCR引物、探针、方法及试剂盒.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN112126717A(43)申请公布日2020.12.25(21)申请号202011062645.XC12Q1/686(2018.01)(22)申请日2020.09.30C12N15/11(2006.01)C12R1/93(2006.01)(66)本国优先权数据202011052128.42020.09.29CN(71)申请人广东省农业科学院动物卫生研究所地址510640广东省广州市天河区五山白石岗街申请人郑州中道生物技术有限公司(72)发明人翟少伦娄亚坤吕殿红翟颀温肖会杨楠杨丹芳(74)专利代理机构广州嘉权专利商标事务所有限公司44205代理人胡辉(51)Int.Cl.权利要求书2页说明书6页C12Q1/70(2006.01)序列表2页附图1页(54)发明名称一种鉴别羊痘病毒和牛结节性皮肤病病毒的双重荧光PCR引物、探针、方法及试剂盒(57)摘要本发明公开了一种鉴别羊痘病毒和牛结节性皮肤病病毒的双重荧光PCR引物、探针、方法及试剂盒，包括两对特异性引物CaPV‑130‑F2、CaPV‑130‑R2和LSD‑132‑F5、LSD‑132‑R6，以及TaqMan‑MGB探针CaPV‑130‑P2和LSD‑132‑LP5探针的5′端标记报告荧光染料为FAM，3′端标记荧光淬灭基团为MGB。本发明提供的试剂盒，可以用于绵羊、山羊、牛的痂皮、丘疹、水泡、血液等样品中的山羊痘病毒、绵羊痘病毒以及牛结节性皮肤病病毒的检测，可为山羊痘病毒属病毒的诊断、流行病学调查、防控及净化提供一定的技术支持与帮助。CN112126717ACN112126717A权利要求书1/2页1.一种用于检测山羊痘病毒属的荧光PCR扩增引物组，其特征在于，所述引物组的核苷酸序列为：CaPV-130-F2:5’-TGGAAGCAAGTGRTAACGK-3’；CaPV-130-R2:5’-CTATTCTATCCCATCATTATACGTA-3’。2.一种用于检测山羊痘病毒属的探针CaPV-130-P2，其特征在于，所述探针的核苷酸序列为：5’-TCATCAAAAGGAAACGGATC-3’；其中，所述探针的5’端标记的荧光基团为FAM，探针序列3’端标记的淬灭基团为MGB。3.一种用于检测牛结节性皮肤病病毒的荧光PCR扩增引物组，其特征在于，所述引物组的核苷酸序列为：CaPV-130-F2:5’-TGGAAGCAAGTGRTAACGK-3’；CaPV-130-R2:5’-CTATTCTATCCCATCATTATACGTA-3’。4.一种用于检测牛结节性皮肤病病毒的探针LSD-132-LP5，其特征在于，所述探针的核苷酸序列为：5’-AGTTCAGTTTTAACATCA-3’；其中，所述探针的5’端标记的荧光基团为VIC，探针序列3’端标记的淬灭基团为MGB。5.一种检测羊痘病毒和牛结节性皮肤病病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1和3所述的引物组、权利要求2和4所述的探针。6.一种检测羊痘病毒和牛结节性皮肤病病毒的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)提取待检样品的DNA；(2)以提取的DNA为模板，用权利要求1、3所述的引物组、权利要求2、4所述探针进行双重荧光PCR扩增，获得扩增曲线；(3)结果判定：对扩增曲线进行分析，判断样品中是否有山羊痘病毒和/或牛结节性皮肤病病毒；该检测方法不适用于疾病的诊断与治疗。7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述的扩增体系为：8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述的扩增程序为：50℃，3min；95-96℃预变性5-6min；95-96℃变性15-20s，58-59℃退火延伸30-34s，循环40-45次。2CN112126717A权利要求书2/2页9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(3)中所述的结果判定步骤如下：1)若待检样品仅FAM通道出现扩增曲线且Ct值≤38，判定为山羊痘病毒属病毒核酸阳性；若38＜Ct值≤40，再次检测为Ct值≤40则判为阳性，无扩增曲线且无Ct值，判为阴性；所述山羊痘病毒属病毒为绵羊痘病毒、山羊痘病毒或牛结节性皮肤病病毒；2)待检样品VIC通道出现典型扩增曲线且Ct值≤38，判定为牛结节性皮肤病病毒核酸阳性；若38＜Ct值≤40，再次检测为Ct值≤40则判为阳性，无扩增曲线且无Ct值，判为阴性。10.权利要求1或3所述的引物、权利要求2或4所述的探针在制备检测山羊痘病毒、绵羊痘病毒和牛结节性皮肤病病毒的试剂盒中的应用。3CN112126717A说明书1/6页一种鉴别羊痘病毒和牛结节性皮肤病病毒的双重荧光PCR引物、探针、方法及试剂盒技术领域[0001]本发明属于病毒检测