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(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN110964857A(43)申请公布日2020.04.07(21)申请号201911342156.7(22)申请日2019.12.24(71)申请人北京森康生物技术开发有限公司地址101400北京市怀柔区凤翔科技开发区内(72)发明人苏莹丁凯杨鹏臧京帅(74)专利代理机构北京丰浩知识产权代理事务所(普通合伙)11781代理人李学康(51)Int.Cl.C12Q1/70(2006.01)C12Q1/686(2018.01)C12R1/93(2006.01)权利要求书2页说明书9页序列表1页附图2页(54)发明名称排除羊痘病毒检测牛结节性皮肤病病毒用试剂盒及制备方法和应用(57)摘要本发明属于生物学技术领域,本发明公开了一种排除羊痘病毒检测牛结节性皮肤病病毒用试剂盒及制备方法和应用。所述的试剂盒包括特异性引物和探针,所述的特异性引物包括上游引物和下游引物,所述的上游引物的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示,所述的下游引物的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示,所述的探针的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示。本发明的试剂盒具有特异性强和灵敏度高的优点。CN110964857ACN110964857A权利要求书1/2页1.一种排除羊痘病毒检测牛结节性皮肤病病毒用试剂盒,其特征在于,所述的试剂盒包括特异性引物和探针,所述的特异性引物包括上游引物和下游引物,所述的上游引物的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示,所述的下游引物的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示,所述的探针的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示。2.根据权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,还包括荧光PCR反应液、TaqDNA聚合酶、阴性对照、阳性对照中的一种或多种。3.一种排除羊痘病毒检测牛结节性皮肤病病毒用试剂盒的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:针对牛结节性皮肤病病毒基因序列,选取G蛋白偶联趋化因子受体基因作为靶区域,从NCBI上下载37条牛结节性皮肤病病毒毒株G蛋白偶联趋化因子受体基因序列,5条绵羊痘病毒毒株G蛋白偶联趋化因子受体基因序列,2条山羊痘病毒毒株G蛋白偶联趋化因子受体基因序列,共44条序列,在多重序列比对的基础上,设计能排除绵羊痘和山羊痘病毒的特异性引物和探针,所述的特异性引物包括上游引物和下游引物,所述的上游引物的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示,所述的下游引物的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示,所述的探针的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示。4.根据权利要求3所述的排除羊痘病毒检测牛结节性皮肤病病毒用试剂盒的制备方法,其特征在于,还包括步骤配制荧光PCR反应液,具体包括如下步骤:配制5×PCR缓冲液的:称取三羟甲基氨基甲烷:3.03g,KCl:9.32g,MgCl2.6H2O:0.76g,聚乙二醇辛基苯基醚:2.5mL,加焦碳酸二乙酯处理水至400mL,调pH值至8.3,定容至500mL,过滤除菌后放在2~8℃保存备用;配制25mmol/LMgCl2溶液:称取0.51gMgCl2.6H2O,加焦碳酸二乙酯处理水定容至100mL,高压灭菌冷却后放在2~8℃保存备用;配制荧光PCR反应液:取2.5mmol/L的dNTPMixture2μL、浓度为10μmol/L的上游引物LSDVF2.5μL、浓度为10μmol/L的下游引物LSDVR2.5μL、浓度为10μmol/L的探针LSDVP0.3μL、5×PCR缓冲液5μL、25mmol/L的MgCl2溶液2μL、焦碳酸二乙酯处理水5.7μL,混匀后用0.45μm滤膜过滤除菌,分装成小管,加贴标签。5.根据权利要求3所述的排除羊痘病毒检测牛结节性皮肤病病毒用试剂盒的制备方法,其特征在于,还包括步骤制备阳性对照和阴性对照;具体包括如下步骤:制备阳性对照:克隆牛结节性皮肤病病毒G蛋白偶联趋化因子受体基因,构建pMD20-T-GPCR载体质粒,对质粒中的G蛋白偶联趋化因子受体基因进行序列测定,测序结果正确后,转化大肠杆菌Top10感受态细胞,将其扩大培养,提取质粒,作为阳性对照;制备阴性对照:量取1mL的焦碳酸二乙酯,加入到双蒸水中并定容至1L,得到体积浓度为0.1%的焦碳酸二乙酯溶液,室温搅拌处理12h,高压121℃蒸汽灭菌15min,作为阴性对照,无菌分装,加贴标签。6.根据权利要求3所述的排除羊痘病毒检测牛结节性皮肤病病毒用试剂盒的制备方法,其特征在于,反应条件为:在0.2mL反应管中加入荧光PCR反应液20μL和TaqDNA聚合酶0.5μL,再加入提取的核酸5.0μL,同时设置阳性及阴性对照管,盖紧管帽,500g离心10s,放入荧光PCR检测仪内,反应条件为:第一阶段94℃/3分钟;第二阶段94℃/15秒,60℃/1分钟,共40个循环