鸡传染性贫血病毒双拷贝感染性克隆及其应用.pdf

(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN115896040A(43)申请公布日2023.04.04(21)申请号202211083620.7(22)申请日2022.09.06(71)申请人山东农业大学地址271018山东省泰安市岱宗大街61号(72)发明人赵鹏王金金王一新常爽(74)专利代理机构山东誉丰合创知识产权代理有限公司37384专利代理师薛鹏喜(51)Int.Cl.C12N7/00(2006.01)C12N15/70(2006.01)C12N15/66(2006.01)C12Q1/70(2006.01)C12R1/93(2006.01)权利要求书1页说明书5页序列表（电子公布）附图3页(54)发明名称鸡传染性贫血病毒双拷贝感染性克隆及其应用(57)摘要本发明公开了一种鸡传染性贫血病毒双拷贝感染性克隆及其应用，属于病毒技术领域。本发明首次采用原核表达载体对CIAV毒株双拷贝克隆株进行构建，构建出的原核表达质粒攻毒SPF雏鸡后，发现可获得CIAV活毒株，并且经过验证，证实获取到的病毒液中除CIAV外，不存在其他外源病毒污染，通过多次试验验证了该方法具有可行性。CN115896040ACN115896040A权利要求书1/1页1.一种鸡传染性贫血病毒双拷贝感染性克隆，其特征在于，由如下方法构建而成：以鸡传染性贫血病毒基因组DNA为模板，利用SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示的引物进行扩增，得到第一扩增产物；将第一扩增产物连接至PMD‑18T载体上，构建得到鸡传染性贫血病毒单拷贝感染性克隆；以鸡传染性贫血病毒基因组DNA为模板，利用SEQIDNO.3和SEQIDNO.4所示的引物进行扩增，得到第二扩增产物；将第二扩增产物连于BamHⅠ酶切后的鸡传染性贫血病毒单拷贝感染性克隆上，即构建得到鸡传染性贫血病毒双拷贝感染性克隆。2.根据权利要求1所述的鸡传染性贫血病毒双拷贝感染性克隆，其特征在于，利用同源重组技术将第二扩增产物连于BamHⅠ酶切后的鸡传染性贫血病毒单拷贝感染性克隆上。3.权利要求1或2所述的鸡传染性贫血病毒双拷贝感染性克隆在制备CIAV拯救病毒液中的应用。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，将所述鸡传染性贫血病毒双拷贝感染性克隆感染雏鸡，获得阳性感染的肝脾病料，研磨获得组织匀浆，与RPMI‑1640培养基混合，离心后收集上清，将上清用0.22μm的滤器过滤除菌，获得CIAV拯救病毒液。5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，将组织匀浆与RPMI‑1640培养基按照体积比1:10的比例进行混合。6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，离心转速为12000r/min，离心时间为2min。7.权利要求1或2所述的鸡传染性贫血病毒双拷贝感染性克隆在CIAV感染与致病机制研究中的应用。2CN115896040A说明书1/5页鸡传染性贫血病毒双拷贝感染性克隆及其应用技术领域[0001]本发明涉及病毒技术领域，具体涉及一种鸡传染性贫血病毒双拷贝感染性克隆及其应用。背景技术[0002]禽用活疫苗安全性一直是企业、养殖户、监管部门非常重视的问题，为保障疫苗质量安全，《中华人民共和国兽用生物制品规程》规定禽用活疫苗SPF化。自我国禽用活疫苗SPF化以来，疫苗源性外源病毒感染报道减少，但仍有SPF鸡胚生产活疫苗存在病毒污染的报道。李阳等人在多种疫苗中检测到CIAV阳性；毛娅卿等人检测到弱毒疫苗中存在禽白血病病毒(Avianleukosisvirus,ALV)的污染；IsmailaShittu等人在尼日利亚商用活疫苗中检测到ALV、CIAV等外源病毒的污染；苏奇等人也报道从弱毒疫苗中分离到禽腺病毒4型(Fowladenovirusserotype4,FADV4)毒株。弱毒疫苗中存在的外源病毒污染计量通常是微弱的，但却易引起疾病爆发，造成巨大经济损失。[0003]鸡传染性贫血病毒(Chickeninfectiousanemiavirus，CIAV)属于圆环病毒科、环状病毒属成员。作为免疫抑制性病毒，CIAV感染雏鸡后，主要攻击骨髓成红血细胞和胸腺皮质前体T细胞，引起贫血，免疫器官萎缩等典型症状。当鸡群中存在CIAV感染时，免疫抑制使得鸡群感染多种病原的几率增加。当疫苗中存在CIAV等垂直传播性免疫抑制病毒污染时，通过疫苗接种会进一步引起鸡群中免疫抑制病的流行，在降低免疫效率的同时又增大多重感染的几率。虽然已经有多个疫苗中CIAV污染的案例，但是其中CIAV致病性还未见系统报道。究其原因，一方面，多数检测均使用分子生物学方法，没有分离到活的CIAV毒株；另一方面，CIAV缺少复制启动蛋白和颈环结构，难以启动DNA复制，并且难以在动物细胞内增殖扩繁。因此，CIAV体外增殖难度大，难以分离到高滴度的CIAV活