一种猪圆环病毒3型病毒样颗粒及其构建方法和应用.pdf

(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN114540393A(43)申请公布日2022.05.27(21)申请号202210236002.5C07K1/34(2006.01)(22)申请日2022.03.11C07K1/22(2006.01)C07K1/36(2006.01)(71)申请人中国农业科学院兰州兽医研究所A61K39/12(2006.01)地址730070甘肃省兰州市盐场堡徐家坪1A61P31/20(2006.01)号C07K16/08(2006.01)(72)发明人孙世琪白满元郭慧琛裴辰辰C12R1/19(2006.01)董虎张韵丁耀忠尹双辉吴金恩郭建宏何继军靳野(74)专利代理机构北京高沃律师事务所11569专利代理师刘奇(51)Int.Cl.C12N15/70(2006.01)C12N1/21(2006.01)C07K14/01(2006.01)C12P21/06(2006.01)权利要求书2页说明书11页序列表1页附图4页(54)发明名称一种猪圆环病毒3型病毒样颗粒及其构建方法和应用(57)摘要本发明涉及一种猪圆环病毒3型病毒样颗粒及其构建方法和应用，属于病毒样颗粒制备技术领域。本发明提供了一种重组质粒，所述重组质粒以pSMA质粒作为基础载体，插入优化好的Cap全长基因，所述优化好的Cap全长基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。本发明克服了现有真核表达系统及传统原核表达系统的不足，使利用原核表达系统可溶性表达猪圆环病毒3型完整Cap蛋白并成功实现病毒样颗粒的制备方法成为可能，且得到的病毒样颗粒免疫原性高，成本低。CN114540393ACN114540393A权利要求书1/2页1.一种重组质粒，其特征在于，所述重组质粒以pSMA质粒作为基础载体，插入优化好的Cap全长基因，所述优化好的Cap全长基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。2.一种重组菌，其特征在于，所述重组菌通过将权利要求1所述重组质粒转化到大肠杆菌BL21中构建得到。3.基于权利要求2所述重组菌的Cap重组蛋白的生产方法，包括以下步骤：将重组菌接种至基础培养基中，在37℃，溶氧30％条件下进行培养，当菌液OD600值为7～10时，使用N源补料培养基进行补料，补料速度为4.5～5.5ml/L/h，继续培养，当菌液OD600值达到40以上时，调整N源补料培养基的补料速度为2.0～3.0ml/L/h，在16℃，溶氧30％条件下培养1h，加入终浓度为0.45～0.6mmol/L的IPTG，诱导培养16h，收集菌泥，提取蛋白，得到Cap重组蛋白。4.根据权利要求3所述的生产方法，其特征在于，所述基础培养基包括以下组分：蛋白胨20g/ml、酵母粉10g/ml、甘油体积百分含量0.25％、硫酸铵1.2g/ml、L‑盐酸精氨酸0.3g/ml、L‑天冬氨酸0.25g/ml、L‑胱氨酸二盐酸盐0.45g/ml、L‑盐酸组氨酸0.5g/ml、L‑亮氨酸0.3g/ml、L‑异亮氨酸0.7g/ml、磷酸氢二钠2.8g/ml、甘氨酸2g/ml、L‑盐酸赖氨酸0.1g/ml、L‑甲硫氨酸0.1g/ml、L‑苯丙氨酸0.2g/ml、L‑脯氨酸0.1g/ml、L‑丝氨酸0.5g/ml、L‑苏氨酸0.3g/ml、L‑色氨酸0.3g/ml、L‑酪氨酸0.1g/ml、L‑缬氨酸0.1g/ml、L‑谷氨酸0.1g/ml、L‑半胱氨酸0.1g/ml、硫酸锌2.8g/ml、硫酸铜1.5g/ml、硝酸铁3.5g/ml、硫酸镍1g/ml、柠檬酸5g/ml、氯化镁6.5g/ml、磷酸二氢钾3g/ml、氯化钙1.5g/ml、葡萄糖1g/ml、蔗糖1g/ml、乳糖1g/ml、生物素1.5g/ml、胆碱0.5g/ml、叶酸1.3g/ml、肌醇0.7g/ml、烟酰胺0.6g/ml、维生素B122g/ml、氯化钾3.6g/ml和氯化钠20g/ml；所述N源补料培养基包括以下组分：酵母粉120g/ml、蛋白胨225g/ml、甘油体积百分含量2.5％、磷酸二氢钾4.5g/ml、磷酸氢二钠5.6g/ml、氯化钙3g/ml、生物素3.6g/ml、氯化钾6.3g/ml、氯化钠50g/ml、L‑盐酸精氨酸0.3g/ml、L‑天冬氨酸0.25g/ml、L‑胱氨酸二盐酸盐0.45g/ml、L‑盐酸组氨酸0.5g/ml、L‑亮氨酸0.3g/ml、L‑异亮氨酸0.7g/ml、磷酸氢二钠2.8g/ml、甘氨酸2g/ml、L‑盐酸赖氨酸0.1g/ml、L‑甲硫氨酸0.1g/ml、L‑苯丙氨酸0.2g/ml、L‑脯氨酸0.1g/ml、L‑丝氨酸0.5g/ml、L‑苏氨酸0.3g/ml、L‑色氨酸0.3g/ml、L‑酪氨酸0.1g/ml、L‑缬氨酸0.1g/ml、L‑谷氨酸0.1g/ml、L‑半胱氨