一种猪圆环病毒3型病毒样颗粒的纯化方法及其应用.pdf

(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN115260297A(43)申请公布日2022.11.01(21)申请号202211039326.6A61K39/12(2006.01)(22)申请日2022.08.29A61P31/20(2006.01)(71)申请人扬州优邦生物药品有限公司地址225008江苏省扬州市维扬经济开发区金槐路7号(72)发明人丁国伟潘晨陈森王设市李甜甜魏荣荣徐萍李琛陈林中日胡越张程(74)专利代理机构哈尔滨市阳光惠远知识产权代理有限公司23211专利代理师林娟(51)Int.Cl.C07K14/01(2006.01)C07K1/16(2006.01)C07K1/18(2006.01)权利要求书1页说明书6页附图3页(54)发明名称一种猪圆环病毒3型病毒样颗粒的纯化方法及其应用(57)摘要本发明公开了一种猪圆环病毒3型病毒样颗粒的纯化方法及其应用，属于生物制品分离纯化技术领域。本发明将表达猪圆环病毒3型病毒样颗粒的培养物进行澄清，澄清液灭活后调pH以便于挂柱，然后，利用更易于猪圆环病毒3型病毒样颗粒挂柱的MMC(复合阳离子)交换柱进行纯化，利用合适的缓冲液洗脱得到纯化样品。本发明方法得到的猪圆环病毒3型病毒样颗粒的纯度高达90％，回收率高达95％。且本发明方法利于生产操作，为猪圆环病毒3型杆状病毒载体灭活疫苗的制备提供了更加安全可靠的途径。CN115260297ACN115260297A权利要求书1/1页1.一种纯化猪圆环病毒3型病毒样颗粒的方法，其特征在于，包括如下步骤：S101：将表达猪圆环病毒3型病毒样颗粒的培养物进行澄清，收集澄清后的上清液并用二乙烯亚胺灭活，以得到半成品；S102：调节半成品的pH值至酸性；S103：将调节pH值后的半成品加入到用第一缓冲液平衡过的混合模式色谱柱中，并用第二缓冲液洗脱混合模式色谱柱，收集流穿峰、洗脱峰；洗脱峰即为猪圆环病毒3型病毒样颗粒；所述第一缓冲液用于平衡柱子，所述第二缓冲液用作洗脱剂。2.根据权利要求1所述的一种纯化猪圆环病毒3型病毒样颗粒的方法，其特征在于，在步骤S101中，表达猪圆环病毒3型病毒样颗粒的培养物的获取方法包括如下步骤：用嵌合有编码猪圆环病毒3型衣壳蛋白的基因的杆状病毒感染昆虫细胞，培养昆虫细胞，以得到表达猪圆环病毒3型病毒样颗粒的培养物。3.根据权利要求2所述的一种纯化猪圆环病毒3型病毒样颗粒的方法，其特征在于，培养昆虫细胞时采用无血清培养基，培养温度为25℃～30℃，转速为130rpm～150rpm，培养时间为96h～144h。4.根据权利要求1所述的一种纯化猪圆环病毒3型病毒样颗粒的方法，其特征在于，在步骤S102中，所述酸性是指pH值为6.0～6.5。5.根据权利要求1所述的一种纯化猪圆环病毒3型病毒样颗粒的方法，其特征在于，第一缓冲液是含有0.1M的NaCl的20mM的PB缓冲液，第一缓冲液的pH为6.5；第二缓冲液是含有1M的NaCl的20mMPB缓冲液，第二缓冲液的pH为6.5。6.根据权利要求1或5所述的一种纯化猪圆环病毒3型病毒样颗粒的方法，其特征在于，在步骤S103中，第二缓冲液的体积为柱体积的3～5倍。7.根据权利要求1所述的一种纯化猪圆环病毒3型病毒样颗粒的方法，其特征在于，在步骤S103中，混合模式色谱柱以MMCPurose6FastFlow为填料。8.应用权利要求1～7任一所述方法纯化得到的猪圆环病毒3型病毒样颗粒。9.含有权利要求8所述猪圆环病毒3型病毒样颗粒的疫苗。2CN115260297A说明书1/6页一种猪圆环病毒3型病毒样颗粒的纯化方法及其应用技术领域[0001]本发明涉及一种猪圆环病毒3型病毒样颗粒的纯化方法及其应用，属于生物制品分离纯化技术领域。背景技术[0002]猪圆环病毒相关疾病(PCVAD)在临床上表现为断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)，呼吸系统和肠道疾病，繁殖障碍，猪皮炎和肾病综合征(PDNS)，猪圆环病毒2型(PCV2)是猪圆环病毒相关疾病主要致病源。2016年在美国发生急性死亡并伴有类似猪皮炎和肾病综合征临床症状且表现繁殖障碍的母猪体内分离出一种新型圆环病毒—猪圆环病毒3型(Porcinecircovirus3，PCV3)。[0003]迄今为止，国内外尚无上市销售的针对PCV3的疫苗，更没有系统化的研究PCV3病毒样颗粒纯化工艺的探索。众所周知，杆状病毒表达的重组亚单位疫苗在临床应用中存在一些过敏反应(如呕吐、震颤等)，这些副反应的产生主要是由于亚单位疫苗未经纯化而引起的。发明内容[0004]本发明提出一种高纯度、高得率、利于生产操作的纯化猪圆环病毒3型病毒样颗粒的方法，包括如下步骤：[0005]S101：将表达猪圆环病毒3型病毒样颗粒的培养物进行澄清，收集澄清后