一种猪圆环病毒II型病毒样颗粒疫苗及其制备方法和应用.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN105999255A(43)申请公布日2016.10.12(21)申请号201610333059.1(22)申请日2016.05.19(71)申请人华南农业大学地址510642广东省广州市天河区五山路483号(72)发明人樊惠英苗配思刘洁高应棋谢永生(74)专利代理机构广东广信君达律师事务所44329代理人杨晓松(51)Int.Cl.A61K39/12(2006.01)A61K39/39(2006.01)A61P31/20(2006.01)权利要求书1页说明书5页序列表3页附图2页(54)发明名称一种猪圆环病毒II型病毒样颗粒疫苗及其制备方法和应用(57)摘要本发明公开了一种猪圆环病毒II型病毒样颗粒疫苗及其制备方法和应用，属于生物制药技术领域。本发明所述的病毒样颗粒疫苗包括可溶性蛋白，该可溶性蛋白为大肠杆菌表达猪圆环病毒II型完整衣壳蛋白基因得到的蛋白。其中该衣壳蛋白基因是筛选自目前国内猪圆环病毒II型流行毒株的衣壳蛋白基因，并且经过密码子优化，不仅能在大肠杆菌中大量表达，而且表达的可溶性蛋白还能形成病毒样颗粒。应用本发明的方法制备的猪圆环病毒II型亚单位疫苗具有抗原纯度高、免疫原性强等特点，此外该疫苗制备过程简单，生产成本低廉，有很好的应用前景。CN105999255ACN105999255A权利要求书1/1页1.一种猪圆环病毒II型病毒样颗粒疫苗的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)合成目的基因：合成两端加入酶切位点的如SEQIDNO：2的基因序列，基因命名为rORF2；(2)重组表达载体质粒的构建：将步骤(1)中获得的rORF2与pET-43.1a空载体分别进行双酶切，然后连接、转化；获取单菌落，培养后之后抽提质粒保存待用，重组质粒命名为pET-43.1a-rORF2；(3)重组表达菌株的构建：将步骤(2)中获得的质粒转化大肠杆菌BL-21(DE3)，获得单菌落，经检测正确后保存，并命名为pET-43.1a-rORF2菌株，即为重组表达菌株；(4)重组蛋白的表达、纯化和去标签：将步骤(3)中构建成功的重组表达菌株pET-43.1a-rORF2进行培养，并加入IPTG诱导表达；收集诱导后的菌体，破碎后经Ni亲和层析柱纯化，在纯化后期加入蛋白酶将目的蛋白与标签切开，收集目的蛋白；(5)疫苗的制备：将步骤(4)中纯化出来的目的蛋白进行浓度测定，然后与佐剂混合、乳化，获得猪圆环病毒II型病毒样颗粒疫苗。2.根据权利要求1所述的猪圆环病毒II型病毒样颗粒疫苗的制备方法，其特征在于：步骤(1)中所述的两端加入酶切位点为BamHI和HindIII两个酶切位点。3.根据权利要求1所述的猪圆环病毒II型病毒样颗粒疫苗的制备方法，其特征在于：步骤(5)中所述的佐剂为法国赛比克公司提供的201佐剂。4.根据权利要求1所述的猪圆环病毒II型病毒样颗粒疫苗的制备方法，其特征在于：步骤(5)中目的蛋白与佐剂的混合比例为体积比1:1。5.一种猪圆环病毒II型病毒样颗粒疫苗由权利要求1～4任一项所述的制备方法获得。6.权利要求1～4任一项所述的制备方法获得的猪圆环病毒II型病毒样颗粒疫苗在制备防治断奶仔猪多系统衰竭综合征的药物中应用。2CN105999255A说明书1/5页一种猪圆环病毒II型病毒样颗粒疫苗及其制备方法和应用技术领域[0001]本发明属于生物制药技术领域，具体涉及一种猪圆环病毒II型病毒样颗粒疫苗及其制备方法和应用。背景技术[0002]猪圆环病毒II型(Porcinecircovirus2，PCV2)是断奶仔猪多系统衰竭综合征(postweaningmultisystemicwastingsyndrome，PMWS)的主要病原，其主要感染6-15周龄的仔猪，临床表现为进行性消瘦、发热、淋巴结肿大、黄疸、呼吸困难等症状。此外，PCV2与猪皮炎与肾炎综合征、猪呼吸道综合征、A2型先天性震颤、猪增生性和坏死性肺炎、繁殖障碍等疾病密切相关。PCV2的危害还在于能够使感染的猪只免疫功能受到损伤，从而导致机体抵抗力下降，使机体容易继发或并发其它感染性疾病，造成更大危害。本病表现为世界流行，已经给世界各国养猪业造成了巨大的经济损失，但对PCV2的致病机制研究仍不透彻，目前仅能通过加强饲养管理、疫苗接种等方法控制该病毒在猪群中的爆发。因此，研发一种廉价且有效地猪圆环疫苗显得尤为迫切。[0003]研究表明PCV2含有两个主要的开放阅读框，分别为ORF1和ORF2，其中ORF1与病毒的复制相关，免疫原性较弱；ORF2为编码该病毒的主要结构蛋白Cap的基因，Cap是病毒的衣壳蛋白，该蛋白含有可中和病毒的抗原表位，还可自我装配成病毒样粒子，因此ORF2是研制新型疫苗的主要候选