猪圆环病毒3型病毒样颗粒、亚单位疫苗及其制备方法与应用.pdf

(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN116024268A(43)申请公布日2023.04.28(21)申请号202211149440.4C12N5/10(2006.01)(22)申请日2022.09.21C07K16/08(2006.01)G01N33/569(2006.01)(71)申请人武汉科前生物股份有限公司G01N33/68(2006.01)地址430074湖北省武汉市东湖新技术开A61K39/12(2006.01)发区高新二路419号A61K39/39(2006.01)(72)发明人汤细彪黄超黄英宋文博A61P31/20(2006.01)余道兵杨柳李倩倩龙云志C12R1/93(2006.01)梁巩周明光徐高原(74)专利代理机构深圳峰诚志合知识产权代理有限公司44525专利代理师张腾(51)Int.Cl.C12N15/867(2006.01)C12N15/34(2006.01)C12N7/04(2006.01)权利要求书2页说明书11页序列表（电子公布）附图8页(54)发明名称猪圆环病毒3型病毒样颗粒、亚单位疫苗及其制备方法与应用(57)摘要本发明公开了一种猪圆环病毒3型病毒样颗粒、亚单位疫苗及其制备方法与应用。构建方法包括以下步骤：(1)在pHBLV‑EF1‑MCS‑CMV‑ZsGreen‑T2A‑PURO载体上插入PCV3cap‑1基因；(2)用构建好的重组质粒与病毒包装质粒共转染293T细胞，得包装好的重组慢病毒液；(3)将包装好的重组慢病毒感染CHO细胞，通过嘌呤霉素初筛选，再通过流式分选细胞仪复筛，最后通过96孔板分选法，获得稳定高表达PCV3cap蛋白的单克隆细胞株。本发明利用重组慢病毒系统制备一种能稳定表达PCV3cap蛋白的单克隆细胞株，同时利用该细胞株表达的PCV3cap蛋白制备了重组亚单位疫苗，对预防猪圆环病毒3型病毒有重要意义。CN116024268ACN116024268A权利要求书1/2页1.一种稳定表达猪圆环病毒3型病毒样颗粒的细胞株的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤S1.合成表达猪圆环病毒3型Cap蛋白变体的核苷酸序列，如SEQIDNO.1、或SEQIDNO.2、或SEQIDNO.3所示；步骤S2.将SEQIDNO.1、或SEQIDNO.2、或SEQIDNO.3所示的核苷酸序列经EcoRI和XbaI酶切，再用T4连接酶连接到载体pHBLV‑EF1‑MCS‑CMV‑ZsGreen‑T2A‑PURO上，分别构建用于表达猪圆环病毒3型Cap蛋白变体的重组慢病毒转移质粒pHBLV‑PCV3cap‑1、或pHBLV‑PCV3cap‑2或pHBLV‑PCV3cap‑3，或将SEQIDNO.1、或SEQIDNO.2、或SEQIDNO.3所示的核苷酸序列经EcoRI和XbaI酶切，再用T4连接酶连接到载体pLenti‑EF1a‑EGFP‑P2A‑Puro‑CMV‑MCS‑3Flag上，分别构建用于表达猪圆环病毒3型Cap蛋白变体的重组慢病毒转移质粒pLenti‑PCV3cap‑1、或pLenti‑PCV3cap‑2、或pLenti‑PCV3cap‑3，然后将构建好的转移质粒与慢病毒包装质粒共转染293T细胞，收取细胞上清即为重组慢病毒，接着将包装好的重组慢病毒感染CHO细胞，通过嘌呤霉素初步筛选出整合了目的基因的阳性细胞株；步骤S3.将初步筛选到的阳性细胞株，用流式分选细胞仪进一步筛选，以提高阳性细胞率；步骤S4.将流式分选后的细胞铺96孔板进行培养，表达猪圆环病毒3型Cap蛋白变体，检测各阳性细胞株的所述蛋白变体的表达量，筛选出阳性且蛋白变体表达量大于阈值的候选细胞株，对筛选出的候选细胞株进行克隆，根据克隆细胞株表达的所述蛋白变体的表达量，挑选出蛋白变体表达量大于阈值的克隆细胞株，进行至少两轮亚克隆，若后一轮的亚克隆细胞株的蛋白表达量相对前一轮不减少、或增加幅度大于阈值，则选为优选细胞株。2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤S2中重组慢病毒转移质粒与慢病毒包装质粒共转染293T细胞的步骤为：共转染4‑6h换新鲜培养液，转染48h后收集病毒上清，将收集的上清以0.45μm滤器过滤，于40ml超速离心管中，4℃，72000g离心120min，置换新鲜培养液；转染后72h分别收集病毒上清，将收集的上清以0.45μm滤器过滤，于40ml超速离心管中，4℃，72000g离心120min，用500μL新鲜培养液重悬病毒沉淀，置于‑80℃液氮保存。3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤S2中将包装好的重组慢病毒感染CHO细胞的步骤包括：感染前一天CHO细胞传代，传代密度为1×106cell/mL，感染当天CHO细胞密度为1.5～2×106cell