一种纳米抗体合成库及其构建方法.pdf

(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN114808147A(43)申请公布日2022.07.29(21)申请号202210082569.1C12N15/70(2006.01)(22)申请日2022.01.24C12N15/66(2006.01)C07K16/00(2006.01)(71)申请人华南农业大学地址510642广东省广州市天河区五山路483号申请人岭南现代农业科学与技术广东省实验室(72)发明人王弘刘飞张奇李迎雪(74)专利代理机构广州粤高专利商标代理有限公司44102专利代理师赵崇杨(51)Int.Cl.C40B50/06(2006.01)C40B40/10(2006.01)C12N15/13(2006.01)权利要求书1页说明书8页序列表3页附图3页(54)发明名称一种纳米抗体合成库及其构建方法(57)摘要本发明公开了一种纳米抗体合成库及其构建方法。本发明的构建方法是选择一种高表达量及高热稳定性纳米抗体骨架区作为合成库的基础抗体框架，再通过纳米抗体序列收集，数据统计分析，确定了随机化区域，随机化策略采用NNK简并密码子引入序列多样性，通过Klenow酶扩增合成片段，以及多次重叠延伸拼接后得到完整的含随机化位点的纳米抗体序列，用于构建高容量、高多样性的纳米抗体合成库。其中，所述框架的表达量大于20mg/L，热稳定性指在50～90℃下加热5～60min仍可维持同室温相近的活性；设计三种长度的CDR3区，并对三个CDR区都进行随机化，最终构建了三种长度不同的纳米抗体合成库，增加文库的序列多样性和结构多样性。CN114808147ACN114808147A权利要求书1/1页1.一种纳米抗体合成库的构建方法，其特征在于，具体步骤如下：(1)纳米抗体框架选定，选择一种高表达量及高热稳定性纳米抗体骨架区作为合成库的基础抗体框架，并确定其FR区，所述框架的表达量大于20mg/L，热稳定性指在50～90℃下加热5～60min仍可维持同室温相近的活性；(2)收集各类纳米抗体序列，统计CDR区氨基酸各位点出现频率及各CDR区氨基酸长度频率，确定合成库随机化位点CDRs区，对CDR3区设计三种不同长度以及结构的氨基酸，并随机化CDR1、CDR2及CDR3区域；(3)根据步骤(1)及步骤(2)所确定的FR区及CDRs区合成四条带有随机化位点的单链DNA片段，四种合成片段分别包含了抗体FR1‑CDR1‑FR2部分，FR2‑CDR2‑FR3部分，FR3部分及FR3‑CDR3‑FR4部分，并设计相应延伸引物将单链DNA通过PCR扩增为双链DNA；(4)通过重叠延伸PCR拼接步骤(3)中各双链DNA片段，获取完整的CDR区随机化纳米抗体基因，再经过酶切和酶连接构建噬菌粒重组载体；(5)将步骤(4)中所构建含抗体基因序列的重组载体通过电击转入感受态细胞，并进行扩培后以辅助噬菌体救援，以构建基于噬菌体展示的纳米抗体合成库。2.根据权利要求1所述构建方法，其特征在于，在步骤(1)中确定的FR区中，FR1区氨基酸个数定为25个，FR2区氨基酸个数定为17个，FR3区氨基酸个数定为38个，FR4区氨基酸个数定为11个。3.根据权利要求1所述构建方法，其特征在于，在步骤(2)中随机化位点通过NNK突变设计引入。4.根据权利要求1所述构建方法，其特征在于，在步骤(3)中特异性延伸引物的序列依次如SEQIDNO.1～4所示；合成的含有随机化位点区域的纳米抗体单链DNA片段的序列依次如SEQIDNO.5～8所示。5.根据权利要求1所述构建方法，其特征在于，在步骤(3)中扩增采用Klenow酶。6.根据权利要求1所述构建方法，其特征在于，在步骤(4)中酶切和酶连接采用SfiⅠ酶切及T4DNA连接酶，重叠延伸PCR采用的引物序列依次如SEQIDNO.9～10和SEQIDNO.13～14所示。7.根据权利要求1所述构建方法，其特征在于，在步骤(5)中感受态细胞采用琥珀抑制型菌株TG1感受态细胞。8.一种纳米抗体合成库，其特征在于，所述纳米抗体合成库通过权利要求1～8任一所述构建方法获得。9.根据权利要求8所述纳米抗体合成库，其特征在于，所示纳米抗体全合成文库的库容不低于1.0×108。2CN114808147A说明书1/8页一种纳米抗体合成库及其构建方法技术领域[0001]本发明属于基因工程技术领域。更具体地，涉及一种纳米抗体合成库及其构建方法。背景技术[0002]噬菌体展示技术是通过基因工程技术将外源基因整合进入噬菌体特定基因中，最终通过噬菌体外壳蛋白展示出具有活性的目的蛋白，该技术普遍应用于抗体库的构建，是基因工程抗体库构建中的常用技术。[0003]纳米抗体(VHH)相对分子质量为12‑15kDa，仅为传统单克隆抗体的十分之一。这使它容易接