Protein A免疫噬菌体展示抗体库的构建方法、ProteinA抗体及其应用.pdf

(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN115992129A(43)申请公布日2023.04.21(21)申请号202211464928.6G01N33/577(2006.01)(22)申请日2022.11.22G01N33/68(2006.01)(71)申请人翌圣生物科技（上海）股份有限公司地址200120上海市浦东新区天雄路166弄1号楼402室(72)发明人易红飞朱倩静向蜀州(74)专利代理机构苏州根号专利代理事务所(普通合伙)32276专利代理师朱华庆(51)Int.Cl.C12N15/10(2006.01)C12N15/70(2006.01)C12N15/13(2006.01)C40B50/06(2006.01)C07K16/12(2006.01)权利要求书2页说明书13页序列表（电子公布）附图6页(54)发明名称ProteinA免疫噬菌体展示抗体库的构建方法、ProteinA抗体及其应用(57)摘要本发明提供一种ProteinA免疫噬菌体展示抗体库的构建方法，其步骤包括：(1)用ProteinA蛋白免疫公鸡，提取淋巴细胞的总RNA，逆转录成cDNA；(2)利用PCR技术扩增重链可变区和轻链可变区片段并拼接成scFv基因；(3)构建pCANTAB5E‑2sfi1‑scFv重组质粒，电转化至TG1感受态细胞，构建噬菌体单链抗体库；(4)特异性富集噬菌体单链抗体库，从中筛选出阳性克隆。本发明通过噬菌体展示抗体库技术筛选得到高亲和力的鸡源单链抗体，并将单链抗体转化为IgY形式，为ProteinA免疫检测试剂盒的抗体原料提供开发方法，利用噬菌体展示技术筛选得到了13株抗ProteinA的单克隆抗体，从中筛选到两株用于双抗夹心ELISA配对(IgY‑80和IgY‑81)，ELISA检测灵敏度高，特异性强。CN115992129ACN115992129A权利要求书1/2页1.一种ProteinA免疫噬菌体展示抗体库的构建方法，其特征在于其步骤包括：(1)用ProteinA蛋白免疫公鸡，提取淋巴细胞的总RNA，逆转录成cDNA；(2)利用PCR技术扩增重链可变区和轻链可变区片段并拼接成scFv基因；(3)构建pCANTAB5E‑2sfi1‑scFv重组质粒，电转化至TG1感受态细胞，构建噬菌体单链抗体库；(4)特异性富集噬菌体单链抗体库，从中筛选出阳性克隆；(5)将阳性单链抗体转化成IgY抗体。2.权利要求1所述的ProteinA免疫噬菌体展示抗体库的构建方法，其特征为：步骤(2)中PCR技术使用的引物如下：IgY‑sfi1‑VH‑F：TCGGGTGGCGGTGGATCCGGCGGTGGCGGTTCGGCCGTGACGTTGGACGAGGCGCTGACTCAGCCGTCGTCGGTGTCIgY‑VH‑R：GGCCAGATCGGCCTAGGACGGTCAGGGTYGIgY‑VL‑F：GGCCCAGCCGGCCGCCGTGACGTTGGACGAGIgY‑sfi1‑VL‑R：CACCGCCACCCGAGCCACCGCCACCGGAGGAGACGATGACTTCGGTCC。3.根据权利要求2所述的ProteinA免疫噬菌体展示抗体库的构建方法，其特征为：步骤(2)中重链VH上游引物和下游引物混合以步骤(1)的cDNA为模板进行PCR，轻链VL上游引物和下游引物混合以步骤(1)的cDNA为模板进行PCR，将获得的轻链VL和重链VH的PCR产物回收并等物质的量混合作为模板，使用引物中相对应的重链上游引物和轻链下游引物进行PCR。4.根据权利要求3所述的ProteinA免疫噬菌体展示抗体库的构建方法，其特征在于：步骤(4)中特异性富集噬菌体单链抗体库，具体指取抗原与PBS混匀后，包被于96孔板，用5％BSA溶液封闭，添加噬菌体单链抗体库，加入BSA溶液孵育；洗脱：加入100mMHCl，室温孵育5min后，用枪头用力吹打后收集，收集孔内加入1MTris‑HCl中和pH混匀；洗脱产物扩增：取洗脱产物加入TG1菌液中培养，加入辅助噬菌体继续培养，菌液离心，用2×YT培养基重悬沉淀，过夜震荡培养；第二天将菌液离心，上清液体转移至新的离心管，加入PEG‑NaCl，冰上静置沉析后离心，然后去除上清，用1％BSA溶液重悬沉淀，转至另一EP管，离心，去除沉淀，上清即为扩增富集产物；重复上述步骤，进行4‑5次淘选，提高每轮淘选严苛程度，富集得到具有亲和力的噬菌体。5.一种ProteinA抗体IgY‑80，其特征在于其氨基酸序列为：重链可变区序列为：AVTLDESGGGLQTPGGTLSLVCKASGFTFSDRGMHWVRQAPGKGLEWVAGTYTSGSITYYAPAVNGRATISRDNGQSTLRLQLNNLRAEDSGTYYCA