一种高效制备交链孢酚的方法.pdf

(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN114875091A(43)申请公布日2022.08.09(21)申请号202210404270.3(22)申请日2022.04.18(71)申请人上海市农业科学院地址201106上海市闵行区北翟路2901号(72)发明人韩铮孟佳佳赵志辉郭文博聂冬霞曹浩杰(74)专利代理机构上海容慧专利代理事务所(普通合伙)31287专利代理师张竹梅(51)Int.Cl.C12P17/06(2006.01)C12N1/14(2006.01)C07D311/80(2006.01)C12R1/645(2006.01)权利要求书2页说明书6页附图3页(54)发明名称一种高效制备交链孢酚的方法(57)摘要本发明提供了一种高效制备交链孢酚的方法，该方法包括如下步骤：将互隔交链孢菌接种在PDA培养基上，黑暗条件下活化；取小块接种于新的培养基进行培养；在旋转涡旋仪上涡旋，收集提取液；提取液过滤、蒸干；乙酸乙酯提取、蒸干；两次中压制备；重结晶。本发明的高效制备交链孢酚的方法，简化了提取净化步骤，保护色谱柱，极大的提高了制备效率的同时显著降低成本。通过本发明的方法制备得到的交链孢酚产量高、纯度高，可作为标准品应用于食品中交链孢酚的检测、防控及其毒理学研究。CN114875091ACN114875091A权利要求书1/2页1.一种高效制备交链孢酚的方法，其特征在于该方法具体包括如下步骤:(1)将互隔交链孢菌接种在PDA培养基上，20‑40℃黑暗条件下活化培养3‑10d；(2)用无菌牙签从步骤(1)得到的PDA培养基菌丝边缘上取小块接种于新的培养基进行培养，培养的条件为：①PDA或PDB培养基，培养基初始pH4‑7，在20‑40℃黑暗条件下培养5‑10d；或者是：②大米或玉米培养基在20‑40℃黑暗条件下培养20‑40d；(3)将步骤(2)得到的培养基转移到锥形瓶中，加入乙腈，在旋转涡旋仪以100‑500rpm/min的速度涡旋1‑5min，然后超声0.5‑3h，重复此步骤2‑5次，收集提取液；(4)将步骤(3)得到的提取液用纱布过滤到旋蒸瓶中，旋转蒸发仪30‑60℃下旋蒸，直至液体全部蒸干；(5)将蒸干后的固体用纯水复溶转移到分液漏斗中，加入乙酸乙酯，乙酸乙酯与水的比例为1：0.5‑3，v/v，剧烈摇晃20‑100次左右，静置等待液体分层，收集上层溶液，重复此步骤2‑5次，将萃取后收集的液体再次旋蒸浓缩至干，得到固体物质；(6)将步骤(5)收集的固体物质经甲醇或乙腈溶解后过0.22μm滤膜，使用中压制备液相仪，依次进行两次中压制备，获得淡黄色固体；(7)将(6)获得的淡黄色固体通过甲醇、乙腈或丙酮进行重结晶，吸去上清液，重复0‑10次，直到上清液澄清透明得到结晶后的交链孢酚。2.根据权利要求1所述的高效制备交链孢酚的方法，其中两次中压制备的条件为：一次制备条件：UnitaryC18制备色谱柱，10mm×250mm，5μm或其它等效柱；流动相A为0.1‑1％的甲酸‑水或者0.1‑1％的乙酸‑水(v/v)，B为甲醇或乙腈，流速为5‑30mL/min，检测波长为256nm，进样量为1mL，收集10～25min馏分液，将馏分液30‑60℃旋蒸浓缩至干，再次复溶后进行二次制备；二次制备条件：UnitaryC18制备色谱柱，10mm×250mm，5μm或其它等效柱；流动相A为0.1‑1％的甲酸‑水或者0.1‑1％的乙酸‑水，B为甲醇或乙腈，流速为5‑30mL/min，检测波长为256nm，进样量为1mL，收集10～25min馏分液，30‑60℃水浴旋蒸后置于冷冻真空干燥机干燥，获得淡黄色固体。3.根据权利要求1或2任一项所述的高效制备交链孢酚的方法，其特征在于该方法包括如下步骤：(1)将互隔交链孢菌接种在PDA培养基上，28℃黑暗条件下活化培养5d；(2)用无菌牙签从步骤(1)得到的PDA培养基菌丝边缘上取小块接种于新的培养基进行培养，培养的条件为：PDA培养基，培养基初始pH6.4，在28℃黑暗条件下培养8d；(3)将步骤(2)得到的培养基转移到锥形瓶中，加入乙腈，在旋转涡旋仪以200rpm/min的速度涡旋2min，然后超声1h，重复此步骤3次，收集提取液；(4)将步骤(3)得到的提取液用纱布过滤到旋蒸瓶中，旋转蒸发仪50℃下旋蒸，直至液体全部蒸干；(5)将蒸干后的固体用纯水复溶转移到分液漏斗中，加入等体积的乙酸乙酯，剧烈摇晃，静置等待液体分层，收集上层溶液，重复此步骤2‑5次，将萃取后收集的液体再次旋蒸浓2CN114875091A权利要求书2/2页缩至干，得到固体物质；(6)将步骤(5)收集的固体物质经甲醇或乙腈溶解后过0.22μm滤膜，使用中压制备液相仪，依次进行两次中压制备，获得淡黄色固体；一次制备条