一种猪瘟病毒病毒样颗粒疫苗的制备方法及应用.pdf

(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN114921495A(43)申请公布日2022.08.19(21)申请号202210673666.8C12N7/01(2006.01)(22)申请日2022.06.15C12N15/64(2006.01)A61K39/12(2006.01)(71)申请人中国农业科学院兰州兽医研究所A61P31/14(2006.01)地址730000甘肃省兰州市城关区盐场堡徐家坪1号(72)发明人郭慧琛尹双辉孙世琪李硕杨顺利尚佑军张辛铭高雪曹钰莹张韵吴锦艳丁耀忠白满元吴金恩刘湘涛董虎(74)专利代理机构兰州智和专利代理事务所(普通合伙)62201专利代理师张英荷(51)Int.Cl.C12N15/866(2006.01)C12N15/40(2006.01)权利要求书4页说明书12页附图4页(54)发明名称一种猪瘟病毒病毒样颗粒疫苗的制备方法及应用(57)摘要一种猪瘟病毒病毒样颗粒疫苗的制备方法，将编码完整的猪瘟病毒结构蛋白的基因通过重组载体分别转染哺乳动物细胞，或将编码完整的猪瘟病毒结构蛋白的基因构建到杆状病毒载体上，繁殖出重组载体杆状病毒P3代病毒，并分别感染昆虫细胞，在体外成功表达出重组猪瘟病毒样颗粒疫苗，将其命名为CSFVVLPs，以其作为抗原免疫动物，能够刺激机体产生抗猪瘟病毒的特异性抗体，所获得的重组猪瘟病毒样颗粒疫苗CSFVVLPs作为预防猪瘟的新型抗原。CN114921495ACN114921495A权利要求书1/4页1.一种猪瘟病毒病毒样颗粒疫苗的制备方法，其特征在于，将编码完整的猪瘟病毒结构蛋白的基因通过重组载体转染哺乳动物细胞，或将编码完整的猪瘟病毒结构蛋白的基因构建到杆状病毒载体上，繁殖出重组载体杆状病毒P3代病毒，并感染昆虫细胞，在体外成功表达出重组猪瘟病毒样颗粒疫苗，将其命名为CSFVVLPs，以其作为抗原免疫动物，能够刺激机体产生抗猪瘟病毒的特异性抗体，所获得的重组猪瘟病毒样颗粒疫苗CSFVVLPs作为预防猪瘟的新型抗原。2.根据权利要求1所述的一种猪瘟病毒病毒样颗粒疫苗的制备方法，其特征在于，所述猪瘟病毒结构蛋白的基因为C、E0、E1、E2，将其命名为E3,获得重组猪瘟病毒疫苗株结构蛋白基因C‑E3和猪瘟病毒石门株结构蛋白基因S‑E3的质粒。3.根据权利要求1所述的一种猪瘟病毒病毒样颗粒疫苗的制备方法，其特征在于，所述哺乳动物细胞为中国仓鼠卵巢细胞‑K1即CHO‑K1细胞、人胚胎肾细胞293株即HEK293细胞。4.根据权利要求1所述的一种猪瘟病毒病毒样颗粒疫苗的制备方法，其特征在于，所述昆虫细胞为sf9细胞、sf21细胞、HighFive细胞。5.根据权利要求1或2或4所述的一种猪瘟病毒病毒样颗粒疫苗的制备方法，其特征在于，将猪瘟病毒疫苗株结构蛋白基因质粒C‑E3和猪瘟病毒石门株结构蛋白基因质粒S‑E3的基因构建到杆状病毒载体上，分别繁殖出重组载体杆状病毒P3代病毒，并分别感染昆虫细胞系sf9细胞、sf21细胞、HighFive细胞，在体外表达出重组猪瘟病毒样颗粒疫苗CSFVVLPs的具体步骤如下：1)、材料Bac‑to‑Bacdonor质粒，DH10Bac感受态细胞，含有杆粒和helper的DN10Bac细胞，E.colipFastBacTM菌株，昆虫细胞系Sf21细胞、Sf9细胞、HighFive细胞，LB平板：Kan，Gen,Tetracycline，Bluo‑gal和IPTG，S0C培养基，重组猪瘟病毒疫苗株结构蛋白基因C‑E3质粒和重组猪瘟病毒石门株结构蛋白基因S‑E3质粒；2)、构建重组质粒2.1置DH10Bac感受态细胞与冰上缓慢解冻；2.2将100ulDH10Bac感受态细胞倒入预冷的15ml管，轻轻地混合；2.3向感受态细胞中分别加入5ng的重组猪瘟病毒疫苗株结构蛋白基因C‑E3质粒和重组猪瘟病毒石门株结构蛋白基因S‑E3质粒，轻轻混合，冰上抚育30分钟；2.442℃热激45秒，立即冰上降温2分钟，随后加入900ul室温的SOC培养基，pFastBac转化:37℃，225转震荡培养4小时；2.5用SOC培养基对pFastBac转化产物做10倍连续稀释，每个稀释℃吸取100ul铺一个LB平板：50ug/mlKan，7ug/mlGentamicin，10ug/mltetracycline，100ug/mlBiuo‑gal，40ug/mlIPTG，2.637℃孵育培养48小时，蓝白斑分析筛选的克隆；2.7鉴定阳性克隆：挑10个白色克隆，重新划线在新鲜LB平板(50ug/mlKan，7ug/mlGentamicin，10ug/mltetracycline，100ug/mlBiuo‑gal，40ug/mlIPTG)，37℃过夜培养；在包含Bl