一种利用发根农杆菌高效快速获得苹果稳定转基因植株的方法.pdf

(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN115896160A(43)申请公布日2023.04.04(21)申请号202211342021.2(22)申请日2022.10.28(71)申请人西北农林科技大学地址712100陕西省咸阳市杨凌示范区邰城路3号(72)发明人李鹏民王玉珠王娱乐(74)专利代理机构北京蕙识同联专利代理事务所(特殊普通合伙)11966专利代理师卫翠婷(51)Int.Cl.C12N15/82(2006.01)C12N15/65(2006.01)A01H5/00(2018.01)A01H6/74(2018.01)A01H4/00(2006.01)权利要求书2页说明书12页附图14页(54)发明名称一种利用发根农杆菌高效快速获得苹果稳定转基因植株的方法(57)摘要本申请属于植物基因工程技术领域，具体公开一种利用发根农杆菌高效快速获得苹果稳定转基因植株的方法，该方法以苹果叶片为受体，利用发根农杆菌介导获得不定芽而非毛状根，再基于不定芽获得可稳定遗转的苹果转基因植株。本申请具有体系稳定、转化率高、操作简单和节约时间等多方优势。CN115896160ACN115896160A权利要求书1/2页1.一种苹果或苹果属的不定芽诱导培养方法，其特征在于，包括如下步骤：1)转基因受体制备：所述受体为苹果叶片；2)表达载体构建；3)农杆菌的转化；4)叶片侵染及共培养；5)不定芽诱导培养。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤3)中，所述农杆菌为发根农杆菌；优选的，所述发根农杆菌包括但不限于发根农杆菌K599、发根农杆菌8196、发根农杆菌R1601或发根农杆菌C58C1。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤5)中，所述不定芽诱导培养获得不定芽，不获得毛状根。4.根据权利要求1‑3任一所述的方法，其特征在于，所述1)中的叶片为嫩叶片；优选的，所述步骤1)制备步骤为：选苹果嫩枝建立苹果植株外植体，外植体继代3‑4次，取顶端嫩叶以下底端老叶以上的组培苗叶片作为转基因的受体。5.根据权利要求1‑4任一所述的方法，其特征在于，所述步骤2)中的载体构建为构建包含目的基因和/或标记基因的表达载体；优选的，所述表达载体包括但不仅限于pCAMBIA1301载体或RNAi沉默PK7WIWG2D‑PGT1::GFP载体。6.根据权利要求1‑5任一所述的方法，其特征在于，所述步骤3)中的转化为将重组表达载体转化到发根农杆菌中，暗培养后至含有乙酰丁香酮的MES‑KOH重悬液中进行侵染；优选的，所述MES‑KOH重悬液为：8‑12mMMES一水合物,5‑15mM氯化镁,0.05‑0.3mM乙酰丁香酮，pH＝5.3‑5.6；更优选的，所述步骤3)转化步骤为：将重组表达载体转化到发根农杆菌中，在含有卡那霉素和链霉素的LB固体平板上，19‑30℃暗培养13d，挑取单菌落于含有卡那霉素和链霉素的液体LB中，25‑28℃，150‑220rpm摇至OD600值达0.8‑1.5范围，室温5000‑7000rpm离心去上清，将菌体重悬至含有乙酰丁香酮的MES‑KOH重悬液中侵染。7.根据权利要求1‑6任一所述的方法,其特征在于，所述步骤4)中侵染采用包括但不仅限于传统划伤或真空渗透；优选的，所述真空渗透方式进行侵染的步骤为：将组培苗叶片置于侵染液中，0.04‑0.1Mpa压力下真空处理，之后将叶片转移至含有乙酰丁香酮和甜菜碱的共培养培养基上培养；更优选的，所述真空渗透方式进行侵染的步骤为：将组培苗叶片置于侵染液中，真空渗透时间1‑60min，真空度0.04‑0.1Mpa下进行渗透处理，真空渗透处理后，用无菌滤纸将叶片表面菌液吸干，将叶片转移至含有乙酰丁香酮和甜菜碱的共培养培养基上，叶片背面朝上正面紧贴培养基进行培养，培养基置于温度25±5℃的条件下，黑暗培养1‑3d。8.根据权利要求1‑7任一所述的方法,其特征在于，所述步骤5)不定芽诱导培养为，将经共培养的苹果叶片转移至不定芽分化培养基，见2CN115896160A权利要求书2/2页光培养获得不定芽；优选的，所述不定芽分化培养基为：MS基础培养基中添加一定浓度的噻苯隆TDZ和/或6‑苄基腺嘌呤6‑BA，和α‑萘乙酸NAA；更优选的，所述不定芽分化培养基为：MS基础培养基+0‑5mg/L的噻苯隆TDZ和/或0‑5mg/L的6‑苄基腺嘌呤+0.05‑3mg/L的α‑萘乙酸NAA+25‑35g/L蔗糖或35‑45g/L山梨醇+6‑8g/L的琼脂粉或2‑3g/L植物凝胶，pH＝5.6‑6.0；进一步优选的，所述步骤5)不定芽诱导培养的具体步骤为：将经共培养的苹果叶片转移至分化培养基，在光强500‑5000lux，光周期12‑18h光照/12‑6h黑暗，温度25±5℃的条件下进行不定