一种降低乌菜小孢子再生植株褐化率的方法.pdf

(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN114982632A(43)申请公布日2022.09.02(21)申请号202210425220.3(22)申请日2022.04.21(71)申请人安徽农业大学地址230036安徽省合肥市长江西路130号申请人安徽省皖江蔬菜产业技术研究院有限责任公司(72)发明人袁凌云张利婷汪承刚张胜男黄兴学朱世东侯金锋唐小燕(74)专利代理机构合肥兴东知识产权代理有限公司34148专利代理师叶曼(51)Int.Cl.A01H4/00(2006.01)权利要求书1页说明书6页(54)发明名称一种降低乌菜小孢子再生植株褐化率的方法(57)摘要本发明提供了一种降低乌菜小孢子再生植株褐化率的方法，步骤如下：待乌菜植株现蕾后，摘取花序；用酒精与HgCl2消毒花蕾，并用无菌水冲洗；释放出小孢子，经过滤、离心得纯化小孢子；将小孢子用NLN培养基稀释、分装到培养皿，并添加0.5mg/g～4mg/g类黄酮和5μg/100g～40μg/100g角黄素；最后，热激处理转至黑暗培养，待出现胚状体振荡培养；将培子叶期胚状体转移到MS培养基上分化培养。本发明的优点在于：通过在小孢子培养基中同时添加类黄酮和角黄素这两种成分来有效提高小孢子抗氧化能力，从而使胚胎发育再生植株的褐化率有效降低，为加快乌菜杂交育种速度、提高育种效率和种质创新提供强有力的基础。CN114982632ACN114982632A权利要求书1/1页1.一种降低乌菜小孢子再生植株褐化率的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)花序的选择待乌菜植株现蕾后，摘取花序，备用；(2)小孢子分离选取花瓣长度与花药长度之比在0.5～1之间的花蕾，用70％酒精与0.1％HgCl2进行组合消毒，弃废液后再用无菌水冲洗；接着，在B5培养基中研碎花蕾释放出小孢子，并先后使用钢丝网筛和细胞网筛过滤；再接着，收集滤液于离心管进行离心；离心后，用B5培养基重悬沉淀后再次离心，所得沉淀即为所需的纯化小孢子；(3)小孢子培养将纯化小孢子用NLN培养基稀释，并调整细胞密度为1×105～2×105个/mL；接着，将稀释后的纯化小孢子分装到培养皿中，并添加0.5mg/g～4mg/g浓度的类黄酮和5μg/100g～40μg/100g浓度的角黄素；最后，在33℃下热激处理24h后转至25℃下黑暗培养，待出现肉眼可见的胚状体后，置于摇床上振荡培养；(4)胚状体萌发及成苗将培养好的子叶期胚状体转移到MS培养基上进行分化培养，直至培养成苗。2.根据权利要求1所述的降低乌菜小孢子再生植株褐化率的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，选择的花序具体为盛花期无虫害且无裂蕾的植株主花序或一级分支的健康花序。3.根据权利要求1所述的降低乌菜小孢子再生植株褐化率的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，选择对应花序后，将其置于自封袋中并喷清水，接着置于4℃冰箱中储存1～2天，备用。4.根据权利要求1所述的降低乌菜小孢子再生植株褐化率的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，对花蕾进行组合消毒的具体方法为：先用70％酒精震荡消毒30s，再用0.1％HgCl2震荡消毒6min；待组合消毒完成，弃废液，再用无菌水冲洗3次，每次5min。5.根据权利要求1所述的降低乌菜小孢子再生植株褐化率的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，待选取的花蕾完成消毒与清洗后，用玻璃棒在B5培养基中研碎花蕾释放出小孢子，并先后使用300目钢丝网筛和细胞网筛过滤；再接着，收集滤液于离心管中，并于1000r/min条件下离心5min；离心后，用B5培养基重悬沉淀，并将重悬液于1000r/min条件下再次离心5min，最终所得沉淀即为目标所需的纯化小孢子。6.根据权利要求1所述的降低乌菜小孢子再生植株褐化率的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，将稀释后的纯化小孢子分装到培养皿中，并添加类黄酮和角黄素时，类黄酮的添加浓度具体为1mg/g，角黄素添加浓度为10μg/100g。7.根据权利要求1所述的降低乌菜小孢子再生植株褐化率的方法，其特征在于，所述步骤(4)中，转移到MS培养基上的子叶期胚状体的长度为2.5～3mm。8.根据权利要求1所述的降低乌菜小孢子再生植株褐化率的方法，其特征在于，所述步骤(4)中，分化培养的培养条件为：25℃，2000lux光照强度。2CN114982632A说明书1/6页一种降低乌菜小孢子再生植株褐化率的方法技术领域[0001]本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种降低乌菜小孢子再生植株褐化率的方法。背景技术[0002]乌菜(BrassicacampesttrisL.ssp.chinesis(L.)Makinovar.rosularisTsenetLee)又名塌菜、塌棵菜、塌地松、黑菜等，为十字花科二年生芸薹属白菜(B.c