一种利用褪黑素提高乌菜游离小孢子出胚率的方法.pdf

(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN114916441A(43)申请公布日2022.08.19(21)申请号202210569081.1(22)申请日2022.05.24(71)申请人安徽农业大学地址230036安徽省合肥市长江西路130号申请人安徽省皖江蔬菜产业技术研究院有限责任公司(72)发明人汪承刚张珮玉袁凌云黄兴学陈国户侯金锋唐小燕赵冠艳单国雷梅林伦李红(74)专利代理机构安徽汇朴律师事务所34116专利代理师刘海涵(51)Int.Cl.A01H4/00(2006.01)A01G7/06(2006.01)权利要求书1页说明书7页(54)发明名称一种利用褪黑素提高乌菜游离小孢子出胚率的方法(57)摘要本发明公开了一种利用褪黑素提高乌菜游离小孢子出胚率的方法，涉及遗传育种技术领域，包括在盛花期对乌菜花蕾喷施浓度为0‑15mg/L的褪黑素，喷施处理24h后采摘相应的花蕾，并置于4℃条件冷激，用于后续小孢子的游离和培养；培养过程包括挑选单核靠边期的花蕾样本进行消毒后研磨，使花药中的小孢子游离出来，然后将研磨液过滤至烧杯中并进行离心处理，获得纯合小孢子等；本发明提供的方法简单，能够有效提高乌菜游离小孢子出胚率。CN114916441ACN114916441A权利要求书1/1页1.一种利用褪黑素提高乌菜游离小孢子出胚率的方法，其特征在于，该方法具体为：步骤1、在盛花期，对乌菜植株的花蕾喷施浓度为0‑15mg/L褪黑素，24h后采摘并置于4℃条件冷激；步骤2、冷激处理后，挑选单核靠边期的花蕾用70％的酒精消毒30s，再用0.1％的升汞消毒6min，最后用无菌水冲洗3次，每次5min，之后放入烧杯中；向烧杯中加入适量B5培养基，用无菌玻璃棒在B5液体中研磨花蕾，使花药中的小孢子游离出来，获得研磨液，令磨液通过300目无菌钢丝网筛过滤至新的50mL无菌小烧杯中，获得滤液；滤液通过细胞网筛二次过滤至50mL无菌离心管中，于8000rmp离心3min，离心处理后弃上清液，用B5培养基重悬浮，再次离心，弃上清液，获得纯合小孢子；用NLN‑13培养基重悬步骤2所得纯合小孢子，并加入活性炭，充分混匀后分装于直径为60mm的培养皿中，于33℃下热激24h后，转移至25℃恒温培箱培养，直至出胚；待出现肉眼可见的胚胎时再转移至25℃的摇床中震荡培养，整个培养过程均再黑暗条件下进行。2.根据权利要求1所述的方法，步骤1中冷激时间为24h。所述步骤2中细胞网筛为40um。3.根据权利要求2所述的方法，所述步骤2中摇床的震荡速度为50rmp/min。2CN114916441A说明书1/7页一种利用褪黑素提高乌菜游离小孢子出胚率的方法技术领域[0001]本发明涉及遗传育种技术领域，尤其涉及一种利用褪黑素提高乌菜游离小孢子出胚率的方法。背景技术[0002]乌菜又叫乌塌菜、塌菜等，是十字花科芸苔属芸苔种白菜亚种的一个变种，主要分布在长江流域，在我国安徽、江苏、上海等众多地区均有种植。乌菜主要以叶片为食，其营养价值丰富，口感鲜美，供货期长，又因其好看的外形广受消费者青睐。[0003]游离小孢子的培养是单倍体育种的重要手段，是基于植物细胞具有全能性的原理，将单核靠边期的小孢子从花药中游离出来，于培养基中进行培养，从而获得再生植株的过程。[0004]芸苔属植物游离小孢子培养，主要是通过添加不同的外源物质来提高小孢子的出胚率。常见的有添加活性炭，阿拉伯半乳糖，谷胱甘肽等，但对乌菜游离小孢子培养的效果并不显著。此外，不同的植物生长调节剂，如NAA、BR、6‑BA等添加在NLN培养基中，对芸苔属小孢子的培养也有着不同程度的影响，找到一种显著提高乌菜游离小孢子出胚率的方法和最佳体系仍迫在眉睫。发明内容[0005]本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种利用褪黑素提高乌菜游离小孢子出胚率的方法，以解决现有技术中乌菜游离小孢子培养效果不显著的技术问题。[0006]本发明是通过以下技术方案实现的：[0007]一种利用褪黑素提高乌菜游离小孢子出胚率的方法，该方法具体为：[0008]步骤1、在盛花期，对乌菜植株的花蕾喷施浓度为0‑15mg/L褪黑素，24h后采摘并置于4℃条件冷激；[0009]步骤2、冷激处理后，挑选单核靠边期的花蕾用70％的酒精消毒30s，再用0.1％的升汞消毒6min，最后用无菌水冲洗3次，每次5min，之后放入烧杯中；[0010]向烧杯中加入适量B5培养基，用无菌玻璃棒在B5液体中研磨花蕾，使花药中的小孢子游离出来，获得研磨液，令磨液通过300目无菌钢丝网筛过滤至新的50mL无菌小烧杯中，获得滤液；滤液通过细胞网筛二次过滤至50mL无菌离心管中，于8000rmp离心3min，离心处理后弃上清液，用B5培养基重悬浮，再次离心，弃上清液