用于检测鰤鱼诺卡氏菌核酸的引物、荧光探针和试剂盒.pdf

(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN115094151A(43)申请公布日2022.09.23(21)申请号202210411190.0(22)申请日2022.04.19(71)申请人仲恺农业工程学院地址510225广东省广州市海珠区纺织路东沙街24号(72)发明人江飚苏友禄孙龑鑫刘春李薇(74)专利代理机构广州海心联合专利代理事务所(普通合伙)44295专利代理师马赟斋(51)Int.Cl.C12Q1/689(2018.01)C12Q1/6851(2018.01)C12N15/11(2006.01)C12R1/365(2006.01)权利要求书1页说明书6页序列表1页附图2页(54)发明名称用于检测鰤鱼诺卡氏菌核酸的引物、荧光探针和试剂盒(57)摘要本发明公开了一种用于检测鰤鱼诺卡氏菌核酸的引物和荧光探针，所述引物包括正向引物和反向引物，所述正向引物如序列表中SEQIDNO.1；所述反向引物如序列表中SEQIDNO.2；所述荧光探针如序列表中SEQIDNO.3。本发明还公开了所述的用于检测鰤鱼诺卡氏菌核酸的引物和荧光探针的用于检测鰤鱼诺卡氏菌核酸的试剂盒。本发明通过在鰤鱼诺卡氏菌基因组中具有多拷贝的ITS上选择一段保守序列，并针对该序列设计引物和探针，使得该引物和荧光探针具有高特异性及高灵敏度，不仅可以检测无发病症状鱼类体内是否存在鰤鱼诺卡氏菌，也可检测养殖水体鰤鱼诺卡氏菌丰度。CN115094151ACN115094151A权利要求书1/1页1.一种用于检测鰤鱼诺卡氏菌核酸的引物和荧光探针，其特征是，所述引物包括正向引物和反向引物，所述正向引物如序列表中SEQIDNO.1；所述反向引物如序列表中SEQIDNO.2；所述荧光探针如序列表中SEQIDNO.3。2.根据权利要求1所述的用于检测鰤鱼诺卡氏菌核酸的引物和荧光探针，其特征是，所述荧光探针的5’端和3’端分别用荧光报告基团和淬灭基团修饰。3.根据权利要求2所述的用于检测鰤鱼诺卡氏菌核酸的引物和荧光探针，其特征是，修饰所述5’端的所述荧光报告基团为：FAM、HEX、ROX、Cy3或Cy5，修饰所述3’端淬灭基团为：TAMRANHS、BHO1、BHO2、BHO3或Eclipse。4.包含权利要求1‑3任一项所述的用于检测鰤鱼诺卡氏菌核酸的引物和荧光探针的用于检测鰤鱼诺卡氏菌核酸的试剂盒。5.根据权利要求4所述的用于检测鰤鱼诺卡氏菌核酸的试剂盒，其特征是，所述正向引物的终浓度为0.1～0.3μM，所述反向引物的终浓度为0.1～0.3μM，所述荧光探针的终浓度为0.3～0.6μM。6.根据权利要求4或5所述的用于检测鰤鱼诺卡氏菌核酸的试剂盒，其特征是，还包括：PCR反应液、核酸释放试剂、阴性质控品和阳性质控品。7.根据权利要求6所述的用于检测鰤鱼诺卡氏菌核酸的试剂盒，其特征是，所述PCR反应液包括：无菌水、具有5’→3’外切活性的DNA聚合酶、dNTP、10×PCRBuffer和含Mg离子的溶液。8.根据权利要求6所述的用于检测鰤鱼诺卡氏菌核酸的试剂盒，其特征是，所述PCR反应液中所述Taq酶的终浓度为0.01～0.03U/μL，所述dNTPs的终浓度为0.2～0.4mM，所述10×PCRBuffer为原浓度的1/10，所述MgCl2的终浓度为1.5～3.0mM，溶剂为无菌水。9.根据权利要求6所述的用于检测鰤鱼诺卡氏菌核酸的试剂盒，其特征是，所述核酸释放试剂包括：无菌水、Triton‑X100、NP‑40和Tris‑HCL；所述阴性质控品为不含鰤鱼诺卡氏菌的ITS基因的PMT18‑T载体质粒DNA；所述阳性质控品为含有所述鰤鱼诺卡氏菌的ITS基因片段的PMT18‑T载体质粒DNA，浓度为50ng/μL；所述具有5'→3'外切活性的DNA聚合酶为Taq酶。10.根据权利要求6所述的用于检测鰤鱼诺卡氏菌核酸的试剂盒，其特征是，所述核酸释放试剂中所述Triton‑X100的终浓度为0.03～0.3％，所述NP‑40的终浓度为0.04～0.4％，所述Tris‑HCL的终浓度为0.01～0.1M，溶剂为无菌水；所述Tris‑HCL的pH值为7.8～8.2。2CN115094151A说明书1/6页用于检测鰤鱼诺卡氏菌核酸的引物、荧光探针和试剂盒技术领域[0001]本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种用于检测鰤鱼诺卡氏菌核酸的引物组、荧光探针和试剂盒。背景技术[0002]鰤鱼诺卡氏菌在分类上属于细菌域、厚壁菌门、放线菌纲、放线菌目、诺卡氏菌科、诺卡氏菌属。鰤鱼诺卡氏菌是水产动物的主要致病菌，宿主广泛，可感染多种淡水和海水鱼类，该菌所致的疾病日益严重，对水产养殖产业造成巨大的经济损失，同时也是水产品质量安全隐患产生的重要因素之一。诺卡氏菌病具有潜伏期时间长、早期症