一种鰤鱼诺卡氏菌减毒株及其制备方法和应用.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN112746050A(43)申请公布日2021.05.04(21)申请号202011534477.X(51)Int.Cl.(22)申请日2020.12.22C12N1/21(2006.01)C12N15/74(2006.01)(83)生物保藏信息A61K39/05(2006.01)GDMCCNo：612572020.10.29A61P31/04(2006.01)(71)申请人广东海洋大学深圳研究院C12R1/365(2006.01)地址518120广东省深圳市大鹏新区滨海二路海洋生物产业园申请人广东海洋大学深圳义海生物科技有限公司(72)发明人夏立群侯素莹鲁义善王文基陈国权(74)专利代理机构北京君泊知识产权代理有限公司11496代理人李丹权利要求书1页说明书8页序列表5页附图1页(54)发明名称一种鰤鱼诺卡氏菌减毒株及其制备方法和应用(57)摘要本发明适用于基因工程技术领域，提供了一种鰤鱼诺卡氏菌减毒株及其制备方法和应用，该鰤鱼诺卡氏菌减毒株为含有丙氨酸脱氢酶基因缺失的鰤鱼诺卡氏菌菌株，其制备方法包括以下步骤：将丙氨酸脱氢酶基因的上游片段和下游片段连接至载体中，得到重组载体；取鰤鱼诺卡氏菌野生株，制备鰤鱼诺卡氏菌感受态细胞；利用重组载体对鰤鱼诺卡氏菌感受态细胞进行电转化，得到电转化菌液；对电转化菌液进行培养和筛选，得到鰤鱼诺卡氏菌减毒株。本发明提供鰤鱼诺卡氏菌减毒株，可用于预防诺卡氏菌病感染，其通过基因敲除的方法缺失丙氨酸脱氢酶基因后，能有效降低细菌的致病性，但仍保留了较好的免疫原性。CN112746050ACN112746050A权利要求书1/1页1.一种鰤鱼诺卡氏菌减毒株，其特征在于，所述鰤鱼诺卡氏菌减毒株为含有丙氨酸脱氢酶基因缺失的鰤鱼诺卡氏菌菌株；所述丙氨酸脱氢酶基因的核苷酸序列如序列表SEQIDNO:1所示，和/或所述丙氨酸脱氢酶的氨基酸序列如序列表SEQIDNO:12所示。2.一种如权利要求1所述的鰤鱼诺卡氏菌减毒株的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将所述丙氨酸脱氢酶基因的上游片段和下游片段连接至载体中，得到重组载体；取鰤鱼诺卡氏菌野生株，制备鰤鱼诺卡氏菌感受态细胞；利用重组载体对鰤鱼诺卡氏菌感受态细胞进行电转化，得到电转化菌液；对电转化菌液进行培养和筛选，得到所述鰤鱼诺卡氏菌减毒株。3.根据权利要求2所述的一种鰤鱼诺卡氏菌减毒株的制备方法，其特征在于，所述将所述丙氨酸脱氢酶基因的上游片段和下游片段连接至载体中，得到重组载体的步骤，具体包括：将所述丙氨酸脱氢酶基因的上游片段作为上游同源臂，将所述丙氨酸脱氢酶基因的下游片段作为下游同源臂，以mLuI和XbaI为酶切位点，经过酶切、酶连至载体中，构建用于同源重组的重组载体。4.根据权利要求2或3所述的一种鰤鱼诺卡氏菌减毒株的制备方法，其特征在于，所述丙氨酸脱氢酶基因的上游片段的核苷酸序列如序列表SEQIDNO:2所示。5.根据权利要求2或3所述的一种鰤鱼诺卡氏菌减毒株的制备方法，其特征在于，所述丙氨酸脱氢酶基因的下游片段的核苷酸序列如序列表SEQIDNO:3所示。6.根据权利要求2或3所述的一种鰤鱼诺卡氏菌减毒株的制备方法，其特征在于，所述载体为pRE112质粒。7.根据权利要求2所述的一种鰤鱼诺卡氏菌减毒株的制备方法，其特征在于，所述步骤中，电转化的电压为180～220V，脉冲间隔时间为800～1200ms。8.根据权利要求2所述的一种鰤鱼诺卡氏菌减毒株的制备方法，其特征在于，所述对电转化菌液进行培养和筛选，得到所述鰤鱼诺卡氏菌减毒株的步骤，具体包括：将电转化菌液涂布于含有氯霉素抗性的脑心浸液琼脂平板上进行培养，得到菌落；将菌落接种至脑心浸液肉汤液体培养基中进行培养，并筛选出缺失丙氨酸脱氢酶基因的鰤鱼诺卡氏菌菌株，得到所述鰤鱼诺卡氏菌减毒株。9.一种如权利要求2～8中任一项所述制备方法制得的鰤鱼诺卡氏菌减毒株。10.一种如权利要求1或9所述鰤鱼诺卡氏菌减毒株在制备诺卡氏菌病疫苗中的应用。2CN112746050A说明书1/8页一种鰤鱼诺卡氏菌减毒株及其制备方法和应用技术领域[0001]本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及一种鰤鱼诺卡氏菌减毒株及其制备方法和应用。背景技术[0002]鰤鱼诺卡氏菌是鱼类诺卡氏菌病的主要病原菌，其在分类上属于细菌域(Bacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)、放线菌纲(Actinobacteria)、放线菌目(Actinobacterales)、诺卡氏菌科(Nocardiaceae)、诺卡氏菌属(Nocardia)。鱼类诺卡氏菌病对水产养殖业危害极大，在亚洲地区养殖鱼类中诺卡氏菌病频发，发病鱼种包括鰤、鲳、大黄鱼、招财鱼、罗非鱼、乌鳢、大口黑鲈、石