一种减毒鰤鱼诺卡氏菌及其制备方法和应用.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN113005069A(43)申请公布日2021.06.22(21)申请号202110121677.0(51)Int.Cl.(22)申请日2021.01.28C12N1/21(2006.01)C12N15/74(2006.01)(83)生物保藏信息C12N15/31(2006.01)GDMCCNo：612592020.10.29A61K39/02(2006.01)(71)申请人广东海洋大学A61K39/39(2006.01)地址524088广东省湛江市麻章区湖光镇A61P31/04(2006.01)海大一路C12R1/365(2006.01)申请人广东海洋大学深圳研究院深圳义海生物科技有限公司(72)发明人夏立群侯素莹鲁义善王文基陈建林刘彦升(74)专利代理机构北京君泊知识产权代理有限公司11496代理人李丹权利要求书1页说明书8页序列表4页附图2页(54)发明名称一种减毒鰤鱼诺卡氏菌及其制备方法和应用(57)摘要本发明适用于基因工程技术领域，提供了一种减毒鰤鱼诺卡氏菌及其制备方法和应用，该减毒鰤鱼诺卡氏菌为缺失血红素蛋白相关蛋白基因的鰤鱼诺卡氏菌菌株；其中，血红素蛋白相关蛋白基因的核苷酸序列如序列表SEQIDNO:1所示，血红素蛋白相关蛋白基因对应的氨基酸序列如序列表SEQIDNO:2所示。本发明提供的减毒鰤鱼诺卡氏菌，可用作疫苗或免疫佐剂；其通过基因敲除的方法缺失血红素蛋白相关蛋白基因后，能有效降低细菌的致病性，但仍保留了较好的免疫原性。另外，由于本发明是在鰤鱼诺卡氏菌基因组上直接进行敲除，菌内不含抗性质粒，符合生物安全，并且不会因为质粒的丢失而影响鰤鱼诺卡氏菌的生长。CN113005069ACN113005069A权利要求书1/1页1.一种减毒鰤鱼诺卡氏菌，其特征在于，所述减毒鰤鱼诺卡氏菌为缺失血红素蛋白相关蛋白基因的鰤鱼诺卡氏菌菌株；所述血红素蛋白相关蛋白基因的核苷酸序列如序列表SEQIDNO:1所示，和/或所述血红素蛋白相关蛋白基因对应的氨基酸序列如序列表SEQIDNO:2所示。2.根据权利要求1所述的一种减毒鰤鱼诺卡氏菌，其特征在于，所述减毒鰤鱼诺卡氏菌命名为鰤鱼诺卡氏菌(Nocardiasp.)ZJ0503‑4036，其保藏号为GDMCCNo：61259。3.一种如权利要求1或2所述的减毒鰤鱼诺卡氏菌的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将所述血红素蛋白相关蛋白基因的上游片段和下游片段连接至载体中，得到重组载体；取鰤鱼诺卡氏菌野生株，制备鰤鱼诺卡氏菌感受态细胞；利用重组载体对鰤鱼诺卡氏菌感受态细胞进行电转化，得到电转化菌液；对电转化菌液进行培养和筛选，得到所述减毒鰤鱼诺卡氏菌。4.根据权利要求3所述的一种减毒鰤鱼诺卡氏菌的制备方法，其特征在于，所述将所述血红素蛋白相关蛋白基因的上游片段和下游片段连接至载体中，得到重组载体的步骤，具体包括：将所述血红素蛋白相关蛋白基因的上游片段作为上游同源臂，将所述血红素蛋白相关蛋白基因的下游片段作为下游同源臂，以SacI和KpnI为酶切位点，经过酶切、酶连至载体中，构建用于同源重组的重组载体。5.根据权利要求3所述的一种减毒鰤鱼诺卡氏菌的制备方法，其特征在于，所述血红素蛋白相关蛋白基因的上游片段的核苷酸序列如序列表SEQIDNO:3所示；所述血红素蛋白相关蛋白基因的下游片段的核苷酸序列如序列表SEQIDNO:4所示。6.根据权利要求3所述的一种减毒鰤鱼诺卡氏菌的制备方法，其特征在于，所述载体为pRE112质粒；所述鰤鱼诺卡氏菌野生株为鰤鱼诺卡氏菌ZJ0503。7.根据权利要求3所述的一种减毒鰤鱼诺卡氏菌的制备方法，其特征在于，所述步骤中，电转化的电压为180～220V，脉冲间隔时间为800～1200ms。8.根据权利要求3所述的一种减毒鰤鱼诺卡氏菌的制备方法，其特征在于，所述对电转化菌液进行培养和筛选，得到所述减毒鰤鱼诺卡氏菌的步骤，具体包括：将电转化菌液涂布于含有氯霉素抗性的脑心浸液琼脂平板上进行培养，得到菌落；将菌落接种至含有蔗糖的脑心浸液肉汤液体培养基中进行培养，并筛选出缺失血红素蛋白相关蛋白基因的鰤鱼诺卡氏菌菌株，得到所述减毒鰤鱼诺卡氏菌。9.一种如权利要求3～8中任一项所述制备方法制得的减毒鰤鱼诺卡氏菌。10.一种如权利要求1或2或9所述减毒鰤鱼诺卡氏菌在制备疫苗或免疫佐剂中的应用。2CN113005069A说明书1/8页一种减毒鰤鱼诺卡氏菌及其制备方法和应用技术领域[0001]本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及一种减毒鰤鱼诺卡氏菌及其制备方法和应用。背景技术[0002]近年来鱼类诺卡氏菌病已经成为水产养殖业中的严重病害，当水产动物体质虚弱、免疫力低下时，病原菌可通过鳃、饲料或者伤口等进行感染