一种埃里希氏菌的荧光定量PCR检测和分型的引物、探针及试剂盒.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局*CN103060468A*(12)发明专利申请(10)申请公布号(10)申请公布号CNCN103060468103060468A(43)申请公布日2013.04.24(21)申请号201310034376.X(22)申请日2013.01.30(71)申请人扬州大学地址225009江苏省扬州市大学南路88号(72)发明人王成明王志强许传灵(74)专利代理机构南京知识律师事务所32207代理人卢亚丽(51)Int.Cl.C12Q1/68(2006.01)C12Q1/10(2006.01)C12N15/11(2006.01)权利要求书1页权利要求书1页说明书4页说明书4页序列表2页序列表2页附图3页附图3页(54)发明名称一种埃里希氏菌的荧光定量PCR检测和分型的引物、探针及试剂盒(57)摘要一种埃里希氏菌的荧光定量PCR检测和分型的引物、探针及试剂盒。所述引物序列如SEQIDNO.1和2所示，所述探针为SEQIDNO.3和4。用上述引物和探针PCR扩增待测菌，扩增出210bp条带，且荧光检测在640nm波长增强的为埃里希氏菌阳性样本；再根据熔解温度可对埃里希氏菌进行分型。本发明的技术优势明显，具有很高的特异性和敏感,且可以方便的检测所有种的埃里希氏菌,可广泛的用于人和各种动物（牛、狗、羊）和人的埃里希氏菌病的确诊和治疗判定，将会产生很好的经济效益。CN103060468ACN103648ACN103060468A权利要求书1/1页1.一种埃里希氏菌的荧光定量PCR检测和分型的引物及探针，其特征在于检测引物为：上游引物：5’-GAGGATTTTATCTTTGTATTGTAGCTAA-3’；下游引物：5’-TGTAAGGTCCAGCCGAACTGACT-3’；检测探针为：探针-1：5’-ACGCGAAAAACCTTACCACTTTTTGAC-6-FAM-3’；探针-2：5‘-LCred640–GAAGGTCGTATCCCTCTTAACAGG-phos-3’。2.一种埃里希氏菌的荧光定量PCR检测和分型试剂盒，包括5倍定量PCR反应液22μl,以及22μl的5倍引物和探针的混合液；所述引物和探针混合液含浓度为5μM的上游引物、5μM下游引物、1μM的探针-1、1μM的探针-2。3.一种埃里希氏菌分型方法，包括以下步骤：（1）用权利要求1所述引物和探针PCR扩增待测菌，扩增出210bp条带，且荧光检测在640nm波长增强的为埃里希氏菌阳性样本；（2）PCR完成后，对步骤（1）埃里希氏菌阳性样本扩增产物进行高分辨率熔解曲线分析，根据熔解温度对埃里希氏菌进行分型，分型标准是：E.chaffensis熔解温度为－57.5℃，E.ruminatium熔解温度为－56℃，E.canis/chafeensis/ovina/muris的熔解温度－63℃。2CN103060468A说明书1/4页一种埃里希氏菌的荧光定量PCR检测和分型的引物、探针及试剂盒技术领域[0001]本发明涉及埃里希氏菌感染的分子诊断的荧光定量PCR检测和分型的引物、探针及试剂盒。背景技术[0002]埃里希氏菌是生存在单核白细胞和嗜中性白细胞的胞浆内的专性细胞内寄生菌。埃里希氏菌病经蜱虫传播，在世界范围内广泛存在，引起人和多种动物(牛、狗、羊)以发热和贫血为主要特征的疫病。此病的临床诊断主要依赖于流行病学和发病症状，结合血液涂片的显微镜观察法检出埃里希氏菌。临床诊断的灵敏度较低，现有的血清学诊断方法不能区分感染后的康复者和临床感染者。[0003]感染人畜的埃里希氏菌的重要的种包括：犬型E.canis,人型E.chafeensis和E.ewingii,牛型E.ruminatium，羊型E.ovina,鼠型E.muris。不同种的埃里希氏菌感染宿主的专一性不强，而现有的分子诊断技术仅可以检测单一种的埃里希氏菌。本发明建立了一套高灵敏度和高特异性、快速的检测埃里希氏菌的、适合临床使用的分子诊断方法。发明内容[0004]为了解决现有分子诊断技术只能检测单一种埃里希氏菌的不足，本发明提供一种快速、特异性强、灵敏度高、适合临床使用的定量PCR检测所有种的埃里希氏菌的引物、探针及试剂盒。[0005]本发明的原理和核心是科学地设计扩增和检测埃里希氏菌的特异、高效的引物和探针。在保证设计的引物高效扩增埃里希氏菌、设计的探针特异检测埃里希氏菌的同时，确保此引物和探针不扩增和检测其它类似的微生物（anaplasma无形体、Bartonella巴尔通体、Rickettsia立克次氏体、Neorickettsia新立克次氏体、Coxiella考克斯氏菌、Mycoplasma支原体）。此外，本发明设计的探针和不同种的埃里希氏菌的基因序列有不同程度的差异（有1-3个碱基的差