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(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN115323070A(43)申请公布日2022.11.11(21)申请号202210771056.1(22)申请日2022.06.30(71)申请人江苏省农业科学院地址210014江苏省南京市玄武区钟灵街50号(72)发明人姜朋张旭吴磊何漪李畅(74)专利代理机构江苏圣典律师事务所32237专利代理师杨文晰(51)Int.Cl.C12Q1/6895(2018.01)C12Q1/6858(2018.01)C12N15/11(2006.01)权利要求书1页说明书19页序列表2页附图3页(54)发明名称小麦籽粒硬度主效基因的多重KASP标记引物组及应用(57)摘要本申请公开一组小麦籽粒硬度主效基因的多重KASP标记引物组及应用,该引物组由核苷酸序列如SEQIDNO.3所示的引物F3、核苷酸序列如SEQIDNO.4所示的引物F4和核苷酸序列如SEQIDNO.5所示的通用引物R1组成;利用该引物组进行多重PCR检测,可以同时对小麦样品中Pina‑D1和Pinb‑D1基因进行检测,相比普通KASP标记检测,效率提升了一倍,而成本降低了一半,有利于大规模育种筛选。CN115323070ACN115323070A权利要求书1/1页1.小麦籽粒硬度主效基因的多重KASP标记引物组,其特征在于,所述引物组由核苷酸序列如SEQIDNO.3所示的引物F3、核苷酸序列如SEQIDNO.4所示的引物F4和核苷酸序列如SEQIDNO.5所示的通用引物R1组成。2.如权利要求1所述引物组在同时检测小麦Pina‑D1和Pinb‑D1基因中的应用。3.如权利要求2所述的应用,其特在于,具体步骤如下:以所述引物F3、引物F4、引物R1组成的多重KASP标记引物组对小麦样品进行PCR扩增,然后对扩增产物进行荧光检测;如果荧光检测结果为蓝色,则说明样品小麦的基因型为Pina‑D1a/Pinb‑D1b,如果荧光检测结果为红色,则说明样品小麦的基因型为Pina‑D1b/Pinb‑D1a,如果荧光检测结果为绿色,则说明样品小麦的基因型为Pina‑D1a/Pinb‑D1a,如果荧光检测结果为黑色,则说明样品小麦的基因型为Pina‑D1b/Pinb‑D1b或空白。4.根据权利要求3所述的应用,其特征在于,所述PCR扩增是指:PCR反应体系:2×KASPMasterMix2.5μL、KASPAssayMix0.07μL,浓度为20ng/μL的小麦模板DNA2.43μL;其中,每100μL所述KASPAssayMix包括:浓度为100μM的所述引物F312μL,浓度为100μM的所述引物F412μL,浓度为100μM的所述引物R130μL,以ddH2O补足至5μL;PCR反应程序为:94℃15min;94℃20s,61‑55℃1min,每个循环降低0.6℃,共10个循环;94℃20s,55℃1min,共26个循环。2CN115323070A说明书1/19页小麦籽粒硬度主效基因的多重KASP标记引物组及应用技术领域[0001]本申请涉及小麦育种领域,特别是一种与小麦籽粒硬度相关的KASP标记及其应用。背景技术[0002]籽粒硬度是小麦品质评价的重要指标,可以反应小麦胚乳的质地,不仅影响小麦磨粉工艺,对润麦加水量、出粉率、面粉颗粒大小、破损淀粉粒数量和食品加工品质也有很大影响,同时也是国内外小麦分类和定价的重要影响因素(王乐凯,赵乃新,高春霞“.小麦主要品质指标及其用法简介”,麦类作物学报,2003,23(1):1;陈锋,李根英,耿洪伟,夏兰芹,夏先春,何中虎,“小麦籽粒硬度及其分子遗传基础研究回顾与展望”中国农业科学,2005,38(6):1088‑1094)。位于小麦5DS染色体的Proindolinea(Pina‑D1)与Puroindolineb(Pinb‑D1)是现有报道中控制籽粒硬度的主效基因,Pina‑D1与Pinb‑D1两者均为野生型时(Pina‑D1a/Pinb‑D1a),籽粒表现为软质,任一亚基缺失或突变,籽粒表现为硬质(胡文静,吴宏亚,董亚超,吴迪,高德荣“.江苏省小麦品种(系)硬度基因分布特点解析”,扬州大学学报,2020,41,DOI:10.16872/j.cnki.1671‑4652.2020.06.005)。[0003]分子标记辅助选择育种可在DNA水平针对目标性状进行选择,不仅结果稳定,而且可以在苗期进行选择,降低表型评价的成本,提高小麦育种效率。关于Pina‑D1与Pinb‑D1的STS标记早有报道(Giroux,M.,Morris,C.Aglycinetoserinechangeinpuroindolinebisassociatedwithwheatgrainhardnessandlow