基于野猪肾细胞的非洲猪瘟病毒抗体免疫荧光检测方法.pdf

(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN115896004A(43)申请公布日2023.04.04(21)申请号202211137583.3(51)Int.Cl.(22)申请日2022.09.19C12N5/071(2010.01)C12N7/00(2006.01)(83)生物保藏信息G01N33/569(2006.01)CCTCCC20222582022.08.10(71)申请人中国农业科学院哈尔滨兽医研究所(中国动物卫生与流行病学中心哈尔滨分中心)地址150069黑龙江省哈尔滨市香坊区哈平路678号(72)发明人赵东明步志高朱远茂李芳孙恩成王婉(74)专利代理机构北京爱棱台知识产权代理事务所(普通合伙)16054专利代理师张洪生武志宏权利要求书2页说明书13页附图10页(54)发明名称基于野猪肾细胞的非洲猪瘟病毒抗体免疫荧光检测方法(57)摘要本发明公开了一种野猪肾细胞，微生物保藏号为CCTCCNO:C2022258。本发明还公开了一种试剂盒，包含前述野猪肾细胞、非洲猪瘟病毒和FITC标记的抗猪IgG抗体，配合常规设备和试剂，应用该试剂盒能够良好地检测猪血清样本中是否含有抗非洲猪瘟病毒抗体。本发明还公开了一种抗非洲猪瘟病毒抗体检测方法，步骤为：用非洲猪瘟病毒感染前述野猪肾细胞，培养感染的细胞后进行固定，将待测血清样本添加到固定的细胞，孵育后再添加FITC标记的抗猪IgG抗体，然后用荧光显微镜拍照，根据拍照结果判定所述待测样本中是否存在抗非洲猪瘟病毒抗体。该方法敏感度高，特异性好，可推广应用。CN115896004ACN115896004A权利要求书1/2页1.一种野猪肾细胞，所述野猪肾细胞的微生物保藏号为CCTCCNO:C2022258。2.一种野猪肾细胞的传代方法，所述传代方法为：在培养基中培养权利要求1所述的野猪肾细胞，得到传代的野猪肾细胞。3.如权利要求2所述的传代方法，其特征在于，所述培养基为RPMI1640培养液；优选地，所述培养的条件为35‑38℃，3‑7％二氧化碳；优选地，所述培养的时间为24‑120h；优选地，所述培养为单层培养；优选地，所述传代的次数为1‑50；优选地，所述传代的次数为10‑30。4.提供了一种野猪肾细胞，所述野猪肾细胞是根据权利要求2或3所述的传代方法传代得到的所述野猪肾细胞。5.一种非洲猪瘟病毒的培养方法，所述培养方法为：用权利要求1或4所述的野猪肾细胞作为培养细胞，培养所述非洲猪瘟病毒。6.如权利要求5所述的培养方法，所述培养方法包括如下步骤：S1：在培养基中培养所述培养细胞，得到增殖的培养细胞；S2：将所述非洲猪瘟病毒接种到所述增殖的培养细胞，得到非洲猪瘟病毒培养体系；S3：培养所述非洲猪瘟病毒培养体系，收获增殖的非洲猪瘟病毒；优选地，在步骤S1中，所述培养时间为72‑96h；优选地，在步骤S2中，所述非洲猪瘟病毒接种剂量为0.05‑0.5MOI，培养时间为72‑144h；优选地，在步骤S3中，所述培养的条件为35‑38℃，3‑7％二氧化碳。7.一种试剂盒，所述试剂盒中含有权利要求1或4所述的野猪肾细胞；优选地，所述试剂盒中还含有非洲猪瘟病毒和荧光分子标记的抗猪IgG抗体；优选地，所述非洲猪瘟病毒为基因I型非洲猪瘟病毒；优选地，所述荧光分子为FITC；优选地，所述抗猪IgG抗体是兔抗猪IgG抗体；优选地，所述抗体是单克隆抗体或多克隆抗体；优选地，述试剂盒中还含有非洲猪瘟病毒阳性血清、非洲猪瘟病毒阴性血清、细胞培养板、PBS溶液、4w/w％多聚甲醛固定液、0.25v/v％Triton‑X100透膜液与RPMI1640培养液中任一种或其组合。8.权利要求1或4所述的野猪肾细胞，权利要求2或3所述的传代方法，权利要求5或6所述的培养方法，或权利要求7所述的试剂盒在如下A1到A9中任一方面中的用途：A1：研究或制备非洲猪瘟预防制剂；A2：研究或制备非洲猪瘟诊断制剂；A3：研究或制备非洲猪瘟病毒检测制剂；A4：研究非诊断目的的非洲猪瘟病毒检测方法；A5：研究非洲猪瘟病毒与抗非洲猪瘟病毒抗体相互作用机制的制剂；A6：研究或制备非洲猪瘟治疗制剂；A7：研究非洲猪瘟病毒遗传机制；2CN115896004A权利要求书2/2页A8：研究非洲猪瘟病毒感染的病理机制；A9：研究或制备干预非洲猪瘟病毒增殖的方法或药物的制剂。9.一种抗非洲猪瘟病毒抗体检测方法，所述检测方法包括如下步骤：P1：用非洲猪瘟病毒感染权利要求1或4所述的野猪肾细胞，得到感染的野猪肾细胞；P2：将所述感染的野猪肾细胞进行固定，得到固定化野猪肾细胞；P3：将待测样本添加到所述固定化野猪肾细胞进行孵育，得到孵育的固定化野猪肾细胞；P4：将荧光分子标记的抗猪IgG抗体添加到所述孵育的固定化野猪肾细胞进行孵育，得到标记