一种Cas12a专用型免疫层析试纸条及其制备方法以及应用.pdf

(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN115932243A(43)申请公布日2023.04.07(21)申请号202210926854.7(22)申请日2022.08.03(71)申请人上海市农业科学院地址201106上海市闵行区北翟路2901号(72)发明人王金斌刘华曾海娟王宇(74)专利代理机构上海开祺知识产权代理有限公司31114专利代理师费开逵(51)Int.Cl.G01N33/543(2006.01)权利要求书2页说明书11页序列表（电子公布）附图4页(54)发明名称一种Cas12a专用型免疫层析试纸条及其制备方法以及应用(57)摘要本发明提供一种Cas12a专用型免疫层析试纸条及其制备方法以及应用，该方法包括步骤：S1：将样品垫和结合垫经不同处理液浸透后干燥；S2：在层析膜上进行检测T线和质控C线的划线，划线条件分别为含0.2％BSA的1mg/mL的羊抗兔二抗和2mg/mL的r‑SA；S3：依次将层析膜、结合垫、样品垫、吸收垫组装于粘性底板上，样品垫、结合垫、层析膜和吸收垫依次排列；S4：剪切制成规定宽度的免疫层析试纸条，密封保存。本发明通过试剂筛选、材料选择、条件优化等制备出一种Cas12a专用型免疫层析试纸条，有利于基于Cas12a的高灵敏可视化检测方法在转基因快速、现场检测等相关领域的应用，具有实际应用价值。CN115932243ACN115932243A权利要求书1/2页1.一种Cas12a专用型免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：S1：样品垫和结合垫的预处理：将样品垫和结合垫经不同处理液浸透后干燥待用，其中，样品垫处理液为：2％葡萄糖、1％TritonX‑100、1％BSA、50mM硼酸，pH8.0，结合垫处理液为：1％蔗糖、3％BSA、0.5％Tween‑20，溶剂为0.01MTris‑base溶液，pH8.0；S2：检测线T和质控线C的划线：使用胶体金点样系统在层析膜上进行检测线T和质控线C的划线，检测线T的划线条件为含0.2％BSA的1mg/mL的羊抗兔二抗，质控线C的划线条件为2mg/mL的r‑SA；S3：组装：依次将完成划线的层析膜、结合垫、样品垫、吸收垫组装于粘性底板上，相邻两者间部分重叠，其中，样品垫、结合垫、层析膜和吸收垫沿层析方向依次排列，质控线C靠近结合垫，检测线T靠近吸收垫；S4：剪切：将组装完成后的复合板剪切制成规定宽度的免疫层析试纸条，于干燥条件下密封保存待用。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，选择CN140为层析膜。3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，还包括在经过处理液预处理后的结合垫上进一步施加4μL胶体金标记FITC抗体，含0.8μgFITC抗体。4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S4中，复合板通过剪切制成3mm宽的免疫层析试纸条。5.一种根据权利要求1～4中任意一项所述的制备方法制备得到的Cas12a专用型免疫层析试纸条。6.一种根据权利要求5所述的Cas12a专用型免疫层析试纸条在转基因作物检测中的应用，其特征在于，包括以下步骤：1)对待检测样品进行基因组DNA提取；2)RPA扩增：以所述基因组DNA为模板，以P‑CaMV35S和T‑NOS为靶标，分别使用与P‑CaMV35S和T‑NOS对应的RPA引物进行RPA扩增反应；3)Cas12a酶切反应：对步骤2)获得的RPA扩增产物进行Cas12a酶切，反应条件为37℃，15min；4)免疫层析试纸条检测：将步骤3)获得的Cas12a酶切产物滴加至所制备的免疫层析试纸条的样品垫处，将所述样品垫的一端浸入层析缓冲液中，竖直静置3～7min，待缓冲液到达吸收纸后将所述免疫层析试纸条取出，观察C线、T线显色情况；当所述免疫层析试纸条同时显出清晰的检测线T和质控线C，表示靶标P‑CaMV35S和/或T‑NOS存在；当所述免疫层析试纸条仅显出一条清晰的质控线C，表示靶标P‑CaMV35S和T‑NOS均不存在；当所述免疫层析试纸条上的检测线T和质控线C均不显现，表示检测失败或试纸条失效。7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤2)中，与所述靶标P‑CaMV35S和T‑NOS对应的RPA引物为：用于检测P‑CaMV35S基因的引物对：RPA‑35S‑F：5'‑CCTCTGCCGACAGTGGTCCCAAAGATGGACC‑3'，RPA‑35S‑R：5'‑CCCTTACGTCAGTGGAGATATCACATCAATCC‑3'；用于检测T‑NOS基因的引物对：2CN115932243A权利要求书2/2页RPA‑NOS‑F：5'‑TGAATCCTGTTGCCGGTCTTGCGATGATTATC‑3'，RPA‑NOS‑R：5'‑TCTATCGCGTATTAAAT