一种用于检测多堆柄锈菌的巢式PCR引物组、试剂盒及其应用.pdf

(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN116004895A(43)申请公布日2023.04.25(21)申请号202211574986.4(22)申请日2022.12.08(71)申请人河北省农林科学院植物保护研究所地址071000河北省保定市东关大街437号(72)发明人马红霞石洁郭宁孙华刘树森张海剑(74)专利代理机构北京卓岚智财知识产权代理有限公司11624专利代理师张旭东(51)Int.Cl.C12Q1/6895(2018.01)C12Q1/686(2018.01)C12N15/11(2006.01)C12R1/645(2006.01)权利要求书1页说明书7页序列表（电子公布）附图1页(54)发明名称一种用于检测多堆柄锈菌的巢式PCR引物组、试剂盒及其应用(57)摘要本发明涉及微生物检测技术领域，公开了一种多堆柄锈菌巢式PCR引物组、试剂盒及其应用。该巢式PCR引物组由外侧上下游引物和内侧上下游引物组成。在所述引物组的基础上建立了多堆柄锈菌的巢式PCR检测体系。利用本发明的巢式PCR引物组及试剂盒对多堆柄锈菌进行检测，检测下限能够达到0.1fg/μL，具有准确性高、特异性强、灵敏度高、检测过程操作简便快速等优点，为玉米南方锈病病原菌的早期诊断和病菌的监测技术发展奠定基础，为玉米的丰产提供保障。CN116004895ACN116004895A权利要求书1/1页1.一种用于检测多堆柄锈菌的巢式PCR引物组，其特征在于，所述巢式PCR引物组由外侧上下游引物和内侧上下游引物组成，所述外侧上下游引物的核苷酸序列分别如SEQIDNo.1和SEQIDNo.2所示，所述内侧上下游引物的核苷酸序列分别如SEQIDNo.3和SEQIDNo.4所示。2.权利要求1所述的巢式PCR引物组在检测多堆柄锈菌试剂中的应用。3.一种检测多堆柄锈菌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的巢式PCR引物组。4.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括PCR反应试剂，所述PCR反应试剂包括TaqDNA聚合酶、Mg2+plusTaqBuffer和dNTPMixture。5.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阳性对照和/或阴性对照，所述阳性对照包括多堆柄锈菌基因组DNA，所述阴性对照不含多堆柄锈菌基因组DNA。6.权利要求1所述引物组或权利要求3～5任意一项所述的试剂盒在检测多堆柄锈菌中的应用。7.一种多堆柄锈菌的巢式PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)以待测样品DNA为模板，用权利要求1所述的外侧上下游引物进行第一轮PCR扩增，得到第一轮PCR扩增产物；(2)以第一轮PCR扩增产物为模板，用权利要求1所述的内侧上下游引物进行巢式扩增，得到巢式扩增产物；(3)对巢式扩增产物进行凝胶检测，若待测样品出现255bp特异性条带，判定为待测样品中含有多堆柄锈菌。8.根据权利要求7所述的巢式PCR检测方法，其特征在于，所述第一轮PCR扩增的反应体系为20μL，包括5U/μL的ExTaqDNA聚合酶0.15μL、10×ExMg2+plusTaqBuffer2μL、2.5mM的dNTPMixture1.6μL、10μM的外侧上下游引物各0.3μL，待测样品DNA模板1μL，ddH2O14.65μL；所述巢式扩增的反应体系为20μL，包括5U/μL的ExTaqDNA聚合酶0.15μL、10×ExMg2+plusTaqBuffer2μL、2.5mM的dNTPMixture1.6μL、10μM的内侧上下游引物各0.3μL，待测样品DNA模板1μL，ddH2O14.65μL。9.根据权利要求7所述的巢式PCR检测方法，其特征在于，所述第一轮扩增的反应程序为：95℃预变性7min；95℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸45sec，30个循环；72℃再延伸7min；所述巢式扩增的反应程序为：95℃预变性7min；95℃变性30sec，66℃退火30sec，72℃延伸26sec，30个循环；72℃再延伸7min。10.权利要求7～9所述的巢式PCR检测方法在以下任意一项中的应用：(1)定性检测收集的病菌、发病玉米植株或有病菌潜伏的玉米叶片中是否含有多堆柄锈菌；(2)对多堆柄锈菌发病情况进行预报预测。2CN116004895A说明书1/7页一种用于检测多堆柄锈菌的巢式PCR引物组、试剂盒及其应用技术领域[0001]本发明属于微生物检测技术领域，具体地涉及一种用于检测南方锈病病菌多堆柄锈菌的巢式PCR引物组、试剂盒及其应用。背景技术[0002]玉米南方锈病是由多堆柄锈菌(PucciniapolysoraUnderw.)引起的一种全球性玉米病害。[0003]目前国内外对玉米南方锈病的研究主要