一种罗非鱼罗湖病毒的恒温快速检测试剂盒.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN107974515A(43)申请公布日2018.05.01(21)申请号201711204371.1(51)Int.Cl.(22)申请日2017.11.27C12Q1/70(2006.01)C12Q1/6844(2018.01)(71)申请人广州双螺旋基因技术有限公司C12N15/11(2006.01)地址510640广东省广州市天河区五山路C12R1/93(2006.01)科华街251号乐天创意园B1012申请人中华人民共和国广州机场出入境检验检疫局广东省水生动物疫病预防控制中心(72)发明人柏建山颜远义黄燕琼高美玲林华剑张璜谢会孙秀秀戴金(74)专利代理机构广州市深研专利事务所44229代理人姜若天权利要求书1页说明书5页附图2页(54)发明名称一种罗非鱼罗湖病毒的恒温快速检测试剂盒(57)摘要本发明公开了一种罗非鱼罗湖病毒的恒温快速检测试剂盒，包括检测罗湖病毒病原的恒温荧光检测引物组，由一对外引物、一对内引物和一对环引物组成，外引物的序列如SEQIDNO:1～SEQIDNO:2所示，内引物的序列如SEQIDNO:3～SEQIDNO:4所示，环引物的序列如SEQIDNO:5～SEQIDNO:6所示。本发明的检测试剂盒特异性好，灵敏度高，对于含有罗非鱼罗湖病毒病原检测靶标基因的阳性质粒，最低检出限可达到1fg/μL，检测时间短，可在45分钟左右获得检测结果，最快10分钟即可得到阳性结果，比常规PCR节约3~4小时。试剂盒采用一步法反应，防污染能力强，杜绝气溶胶污染。操作便捷，易于推广。试剂盒对人和环境较安全，原料成分及产物中不含有毒物质。CN107974515ACN107974515A权利要求书1/1页1.一种罗非鱼罗湖病毒的恒温快速检测试剂盒，其特征在于包括检测罗湖病毒病原的恒温荧光检测引物组，由一对外引物、一对内引物和一对环引物组成，一对外引物的序列为：F3：GTACCAGCAGATTTGTAAGGT，B3：CTATCACGTGCGTACTCG；一对内引物的序列为：FIP：CCACTCAATACGAGGCTTCGGCATCCTACGATGCTGAGC，BIP：CCAGACTTGCGGACATATCCAACAGGCGAGGAACTTTGAG；一对环引物的序列为：LF：TGGTAGTTCCAATAGCCGTTC，LB：AGGCAATATGGATTCTTCGAGT。2.如权利要求1所述的恒温快速检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中引物组的外引物、内引物和环引物的摩尔比为1～2：4～8：2～4。3.如权利要求2所述的恒温快速检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中引物组的外引物、内引物和环引物的摩尔比为1：4：2。4.如权利要求1所述的恒温快速检测试剂盒，其特征在于，还包括DNA聚合酶，反转录酶，2×反应缓冲液，荧光染料，密封液，标准阳性模板和阴性对照。5.如权利要求4所述的恒温快速检测试剂盒，其特征在于，所述的2×反应缓冲液由buffer缓冲液、甜菜碱和dNTPs组成，buffer缓冲液、甜菜碱与dNTPs的体积比为10：8：7。6.如权利要求4所述的恒温快速检测试剂盒，其特征在于，所述DNA聚合酶为BstDNA聚合酶，所述反转录酶为AMV反转录酶，所述荧光染料为0.02mMSYTO-9，所述密封液为矿物油。7.如权利要求4所述的恒温快速检测试剂盒，其特征在于，所述标准阳性模板为含有罗非鱼罗湖病毒病原检测靶标基因的质粒DNA，所述阴性对照为灭菌超纯水。8.如权利要求1所述的恒温快速检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的反应体系的成分组成为：引物F3、B3、FIP、BIP、LF、LB在反应体系中的终浓度分别为0.2μM、0.2μM、0.8μM、0.8μM、0.4μM、0.4μM，2×反应液12.5μL，DNA聚合酶8U，反转录酶2U，0.02mMSYTO-90.5μL，待检样品2μL，加灭菌超纯水至25μL；反应体系的反应条件为63℃反应45～60min，并在80℃持续2min。2CN107974515A说明书1/5页一种罗非鱼罗湖病毒的恒温快速检测试剂盒[0001]技术领域[0002]本发明属于对鱼类病毒检测领域，特别涉及一种用于罗非鱼湖病毒的监测及诊断技术。[0003]背景技术[0004]2017年5月26日，粮农组织全球信息及预警系统发布特别警报：一种传染性很强的疾病正在养殖和野生罗非鱼中传播。现已查明导致该疾病的病原物名为“罗湖”病毒（TilapiaLakeVirus，TiLV）。罗湖病毒（TiLV）是一种传染性很强的病毒,可导致受感染鱼群大量死亡，死亡率高达80%~90%。2009年罗湖病毒在以色列和厄瓜多尔首次被报道，后来在三大洲的5个国家都发现