冻存液在胆囊干细胞中的应用及胆囊干细胞的复苏方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN112655700A(43)申请公布日2021.04.16(21)申请号202011536122.4(22)申请日2020.12.23(71)申请人上海拜羡生物科技有限公司地址201318上海市浦东新区青黛路588号3号楼(72)发明人陈锐赵健(74)专利代理机构上海伯瑞杰知识产权代理有限公司31227代理人范艳静(51)Int.Cl.A01N1/02(2006.01)C12N5/071(2010.01)权利要求书1页说明书6页附图2页(54)发明名称冻存液在胆囊干细胞中的应用及胆囊干细胞的复苏方法(57)摘要本发明提供了一种冻存液在胆囊干细胞中的应用及胆囊干细胞的复苏方法，冻存液包括：3‑6v/v％二甲亚砜、8‑12w/v％人血清白蛋白、DMEM/F12培养基、N‑乙酰半胱氨酸和抑制剂Y‑27632；复苏体系包括复苏方法和复苏液，复苏液包括：人血清白蛋白和DMEM/F12培养基；本发明的细胞冻存液和复苏体系中细胞在冻存复苏后，活率和复苏率仍达到90％以上，优于传统冻存液；另外冻存液中不含有胎牛血清成分，彻底杜绝动物源蛋白引起的过敏反应，以及相关动物病毒的污染介入；二甲亚砜含量减少，降低了冻存液毒性对干细胞存活率的影响；DMEM/F12培养基和人血清白蛋白含有丰富的营养元素，从而保证了细胞的存活率。CN112655700ACN112655700A权利要求书1/1页1.一种冻存液在胆囊干细胞中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述冻存液包括如下组分：3‑6v/v％的二甲亚砜、8‑12w/v％的人血清白蛋白、40‑50v/v％的DMEM/F12培养基、浓度为0.5‑2mmol/L的N‑乙酰半胱氨酸和浓度为5‑15μmol/L的抑制剂Y‑27632。3.一种胆囊干细胞复苏液，其特征在于：其包括如下组分：3‑5w/v％的人血清白蛋白和75‑85v/v％的DMEM/F12培养基。4.根据权利要求3所述的胆囊干细胞复苏液，其特征在于：所述人血清白蛋白的浓度为4w/v％，DMEM/F12培养基的浓度为80v/v％。5.一种胆囊干细胞的复苏方法，利用权利要求3所述的胆囊干细胞复苏液复苏胆囊干细胞；所述胆囊干细胞为权利要求1所述的胆囊干细胞。6.根据权利要求5所述的复苏方法，其特征在于：其包括如下步骤：将冻存细胞悬液在37℃下溶解后，与权利要求3所述的胆囊干细胞复苏液逐滴混合，继续添加DMEM/F12培养基，离心收集。7.根据权利要求6所述的复苏方法，其特征在于：其包括：(1)、冻存液的制备：制备权利要求1所述的冻存液。(2)、冻存细胞悬液的制备：将胆囊干细胞体外培养后，离心，收集的胆囊干细胞与所述冻存液混合重悬得到细胞悬液，置于冻存管中；冷冻：将冻存管降温至‑80度，24‑72h，然后转移至液氮中冷冻保存；细胞复苏：取出冻存管置于37℃水浴溶解为冻存细胞悬液。8.一种冻存液在胆囊干细胞冻存复苏中的应用。2CN112655700A说明书1/6页冻存液在胆囊干细胞中的应用及胆囊干细胞的复苏方法技术领域[0001]本发明属于生物医学技术领域，具体涉及一种冻存液在胆囊干细胞中的应用及胆囊干细胞的复苏方法。背景技术[0002]干细胞是一类具有自我更新能力和多向分化潜能的细胞，通过这些性质，干细胞在机体的发育、生长、损伤修复和免疫调控等方面发挥着重要的作用。同时，干细胞这些功能使其在临床治疗和再生医学领域的应用前景十分广阔。[0003]胆囊干细胞来源于肝内胆管、胆管或胆囊上皮细胞，在体外合适的培养条件下，具有较强的增殖能力，可稳定扩增。在特定的培养条件下，胆囊干细胞在体外可以特异地分化肝细胞样细胞和胆管细胞。这些都为胆囊干细胞应用于治疗肝脏和胆管系统疾病的治疗提供了重要的基础。[0004]胆囊干细胞分离获得数量有限，而临床应用量较大，所以需经过体外大量扩增，同时其扩增过程中为保证细胞的质量以及细胞应用期间的稳定性，需要根据细胞传代次数对细胞进行深低温冻存。目前，细胞冻存技术一般是液氮冷冻保存法，通过添加适量保护剂，比如最常用的二甲亚砜，将细胞缓慢冷冻。若不添加保护剂，细胞直接冷冻，细胞内外的水分会很快形成冰晶，能导致细胞内发生一系列的变化，如机械损伤、电解质浓度升高、渗透压改变、脱水、pH值改变和蛋白质变性等，引起细胞死亡。而较高浓度的二甲亚砜具有一定的生物毒性，会降低细胞活率，诱导干细胞分化。另一种最常用的细胞保护营养成分胎牛血清，因为含有动物蛋白成分，可能残留在冻存复苏后的细胞中，应用于临床治疗时易引发人体不良免疫反应，同时胎牛血清具有携带动物病毒，存在致人感染的风险。另外，而胆囊干细胞对生存环境要求极高，传统的无血清冻存液及复苏体系会导致该干细胞因冻存而大