一种建兰茎腐病菌LAMP检测引物组及其快速检测方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN109182591A(43)申请公布日2019.01.11(21)申请号201811312674.X(22)申请日2018.11.06(71)申请人福建省农业科学院植物保护研究所地址350013福建省福州市晋安区新店镇埔党村100号(72)发明人姚锦爱余德亿黄鹏陈南川(74)专利代理机构福州元创专利商标代理有限公司35100代理人蔡学俊(51)Int.Cl.C12Q1/6895(2018.01)C12Q1/6844(2018.01)C12Q1/04(2006.01)C12N15/11(2006.01)C12R1/77(2006.01)权利要求书1页说明书7页序列表1页附图2页(54)发明名称一种建兰茎腐病菌LAMP检测引物组及其快速检测方法(57)摘要本发明提供了一种建兰茎腐病菌LAMP检测引物组及其快速检测方法。用于检测建兰茎腐病菌的LAMP引物组由1对外侧引物F3/B3和1对内侧引物FIP/BIP组成，F3/B3和FIP/BIP引物序列如SEQID.1-4所示。包括以下步骤：1）提取待测样品DNA；2）进行LAMP扩增；3）使用荧光染料SYBRGreenI对扩增结果进行显色或琼脂糖凝胶电泳对扩增产物进行检测。本发明能快速、方便、高效、高特异、高灵敏地检测到建兰茎腐病菌，不需要复杂昂贵的仪器，能较好地满足对建兰茎腐病菌的现场快速检测，可广泛应用于基层单位田间病害的早期诊断和病菌的监测、鉴定，为防治建兰茎腐病提供可靠的技术和理论依据。CN109182591ACN109182591A权利要求书1/1页1.一种建兰茎腐病菌LAMP检测引物组，其特征在于所述引物组由1对外侧引物F3/B3和1对内侧引物FIP/BIP组成，F3/B3和FIP/BIP引物序列包括如下：F3:5’-GCCTGTTCGAGCGTCATT-3’；B3:5’-ACCTGATCCGAGGTCAACAT-3’；FIP:5’-GCCAATCAATTTGGGGAACGCGTCAACCCTCAAGCACAGC-3’；BIP:5’-GGTCACGTCGAGCTTCCATAGCAGTTGGGGTTTAACGGCG-3’。2.如权利要求1所述的引物组在建兰茎腐病菌LAMP快速检测中的应用。3.根据权利要求2所述引物组在建兰茎腐病菌LAMP快速检测中的应用，其特征在于，其检测方法包括以下步骤：（1）提取待测样品基因组DNA；（2）LAMP反应体系的建立：以步骤（1）提取的DNA为模板，利用权利要求1所述的外侧引物F3/B3和内侧引物FIP/BIP进行LAMP扩增，LAMP检测反应体系为25μL，其中包括以下终浓度成分：20mMTris-HCl、10mM(NH4)2SO4、6.0mMMgSO4、50mMKCl、0.8mM甜菜碱、1.4mmol·L-1dNTPs、8UBstDNA聚合酶、1.6μmol·L-1的FIP和BIP、0.2μmol·L-1的F3和B3，50-100ng的模板DNA，无菌双蒸水补充至25μL，在PCR管盖上加入2μL的1000×SYBRGreenⅠ；（3）LAMP反应条件：65℃温育60min，85℃灭活10min，冰上终止反应；（4）反应结果的测定：采用荧光染料目测观察法或琼脂糖凝胶电泳法进行测定；所述荧光染料目测观察法具体方法为，待LAMP反应结束后，瞬时离心，将SYBRGreenⅠ离心到PCR管的底部，观察颜色变化，显色结果观察到绿色荧光的判断为阳性，存在建兰茎腐病菌，橙色或橘黄色判断为阴性，不存在建兰茎腐病菌；所述琼脂糖凝胶电泳法具体方法为，取2.0μLLAMP扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测，出现梯形条带判断为阳性，存在建兰茎腐病菌，没有出现条带则判断为阴性，不存在建兰茎腐病菌。4.如权利要求1-3任一所述的引物组在建兰茎腐病菌的早期诊断、监测和鉴定上的应用。2CN109182591A说明书1/7页一种建兰茎腐病菌LAMP检测引物组及其快速检测方法技术领域[0001]本发明属于园艺作物病害检测、鉴定及防治技术领域，具体涉及一种建兰茎腐病菌LAMP检测引物组及其快速检测方法，可用于建兰茎腐病菌快速、灵敏和特异的分子检测，以及建兰茎腐病的早期诊断和病菌的监测和鉴定。背景技术[0002]茎腐病是建兰生产上最严重的一种世界性土传病害，有“兰花癌症”和“兰花杀手”之称，其致病菌为尖孢镰刀菌（Fusariumoxysporum）。自2010年马来西亚槟城首次报道之后，世界各地的兰花种植区普遍发生。该病是一种由土壤传染，从根或根茎部或伤口侵入，在维管束内寄生的系统性病害，是建兰生产上较难防治的病害之一，该病由于具有发病快、病害重、传播迅速等特点，一旦发生常造成经济巨大损失。此病的初侵染源