梅毒螺旋体IgM抗体Dot-ELISA检测方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN105548578A(43)申请公布日2016.05.04(21)申请号201610100361.2(22)申请日2016.02.23(71)申请人厦门大学深圳研究院地址518057广东省深圳市南山区高新南四道019号虚拟大学园R4-A601申请人厦门大学附属中山医院(72)发明人杨天赐童曼莉张惠林林丽蓉刘莉莉(74)专利代理机构厦门南强之路专利事务所(普通合伙)35200代理人马应森(51)Int.Cl.G01N33/68(2006.01)G01N33/569(2006.01)G01N33/545(2006.01)权利要求书1页说明书4页附图1页(54)发明名称梅毒螺旋体IgM抗体Dot-ELISA检测方法(57)摘要梅毒螺旋体IgM抗体Dot-ELISA检测方法，涉及梅毒特异性IgM抗体的检测。制备重组抗原包被的硝酸纤维素膜；制备抗人γ链单克隆抗体；抗人μ链单克隆抗体的辣根过氧化物酶标记；硝酸纤维素膜洗涤；加入辣根过氧化物标记的抗人μ链单克隆抗体孵育；磷酸盐缓冲液洗涤，显色；加入磷酸盐缓冲液洗涤液漂洗，弃液体；结果判读：硝酸纤维素膜上斑点呈棕色阳性，无色为阴性。重组抗原包被的硝酸纤维素膜延长已包被抗原的保存时间，可实现单个样本独立保存，避免反复冻融造成的抗原变性；应用斑点酶联免疫吸附法检测梅毒特异性IgM抗体不需要特殊仪器，可实现大规模的筛查，应用范围广，实用性强。CN105548578ACN105548578A权利要求书1/1页1.梅毒螺旋体IgM抗体Dot-ELISA检测方法，其特征在于包括如下步骤：1)采用基因克隆技术，PCR扩增编码梅毒螺旋体抗原的DNA，并插入大肠杆菌中使其表达，得梅毒螺旋体特异性重组抗原TPN17和TPN47；2)在硝酸纤维素的光滑面上压迹成圆形小孔，作为点样部位；用微量取液器取0.5μL抗原混合物，加至硝酸纤维素膜上的压迹中央，干燥；将点样后的的硝酸纤维素膜片浸于奶粉中封闭；将封闭后之硝酸纤维素膜置于磷酸盐缓冲液中漂洗，得重组抗原包被的硝酸纤维素膜，简称快诊膜，存放于阴晾干燥处备用；3)以人μ链为抗原免疫Balb/c小鼠，通过杂交瘤技术，筛选获得杂交瘤细胞株，稳定分泌抗人μ链单克隆抗体；4)采用过碘酸钠法进行抗人μ链单克隆抗体的辣根过氧化物酶标记；5)将步骤2)得到的重组抗原包被的硝酸纤维素膜沿压迹或划痕剪下，光滑面向上置于的聚苯乙烯微量反应板孔中,每孔中加入待检样品50μL，37℃孵育10min；6)将硝酸纤维素膜用磷酸盐缓冲液洗涤，洗涤后弃液体；7)加入50μL步骤4)中辣根过氧化物标记的抗人μ链单克隆抗体，37℃孵育10min；8)用磷酸盐缓冲液洗涤，洗涤后弃液体；9)加入显色剂，37℃放置5min后，再加入磷酸盐缓冲液洗涤液漂洗，弃液体；10)结果判读，硝酸纤维素膜上斑点呈棕色阳性，无色为阴性。2.如权利要求1梅毒螺旋体IgM抗体Dot-ELISA检测方法，其特征在于在步骤2)中，所述在硝酸纤维素的光滑面上压迹成圆形小孔是采用直径6mm的圆形打孔器在硝酸纤维素的光滑面上压迹成圆形小孔。3.如权利要求1梅毒螺旋体IgM抗体Dot-ELISA检测方法，其特征在于在步骤2)中，所述奶粉采用质量百分浓度为5％的脱脂奶粉。4.如权利要求1梅毒螺旋体IgM抗体Dot-ELISA检测方法，其特征在于在步骤2)中，所述封闭的时间为30min。5.如权利要求1梅毒螺旋体IgM抗体Dot-ELISA检测方法，其特征在于在步骤2)中，所述磷酸盐缓冲液采用摩尔浓度为0.01mmol/L，pH为7.4的磷酸盐缓冲液。6.如权利要求1梅毒螺旋体IgM抗体Dot-ELISA检测方法，其特征在于在步骤2)中，所述漂洗是漂洗3次，每次2min。7.如权利要求1梅毒螺旋体IgM抗体Dot-ELISA检测方法，其特征在于在步骤6)中，所述磷酸盐缓冲液采用350μL摩尔浓度为0.01mmol/L，pH为7.4的磷酸盐缓冲液；所述洗涤可洗涤3次，每次2min。8.如权利要求1梅毒螺旋体IgM抗体Dot-ELISA检测方法，其特征在于在步骤8)中，所述磷酸盐缓冲液采用350μL摩尔浓度为0.01mmol/L，pH为7.4的磷酸盐缓冲液；所述洗涤可洗涤3次，每次2min。9.如权利要求1梅毒螺旋体IgM抗体Dot-ELISA检测方法，其特征在于在步骤9)中，所述显色剂可采用3,3-二氨基苯联胺；显色剂的加入量可为50μL；所述3,3-二氨基苯联胺按50mg3,3-二氨基苯联胺加入摩尔比0.05mol/L的Tris-Hcl缓冲生理盐水100ml配制。10.如权利要求1梅毒螺旋体IgM抗体Dot-ELISA检测方法，其特征在于在步骤9)中，所述磷酸盐缓冲液采