梅毒螺旋体总抗体Dot-ELISA检测方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN105652006A(43)申请公布日2016.06.08(21)申请号201610099172.8(22)申请日2016.02.23(71)申请人厦门大学附属中山医院地址361004福建省厦门市思明区湖滨南路201-209号(72)发明人童曼莉张惠林杨天赐林丽蓉刘莉莉(74)专利代理机构厦门南强之路专利事务所(普通合伙)35200代理人马应森(51)Int.Cl.G01N33/577(2006.01)权利要求书2页说明书4页附图1页(54)发明名称梅毒螺旋体总抗体Dot-ELISA检测方法(57)摘要梅毒螺旋体总抗体Dot-ELISA检测方法，涉及梅毒特异性总抗体的检测。制备梅毒螺旋体特异性重组抗原；制备重组抗原包被的硝酸纤维素膜；制备抗人Ig单克隆抗体；抗人Ig单克隆抗体的辣根过氧化物酶标记；将重组抗原包被的硝酸纤维素膜沿压迹或划痕剪下,光滑面向上置于的聚苯乙烯微量反应板孔中,每孔中加入待检样品孵育；硝酸纤维素膜洗涤；加入辣根过氧化物标记的抗人Ig单克隆抗体孵育；磷酸盐缓冲液洗涤，洗涤后弃液体；加入显色剂，放置，磷酸盐缓冲液洗涤液漂洗，弃液体；结果判读，硝酸纤维素膜上斑点呈棕色阳性，无色为阴性。不需要特殊仪器，可实现大规模的筛查，应用范围广，实用性强。CN105652006ACN105652006A权利要求书1/2页1.梅毒螺旋体总抗体Dot-ELISA检测方法，其特征在于包括如下步骤：1)采用基因克隆技术，PCR扩增编码梅毒螺旋体抗原的DNA，并插入大肠杆菌中使其表达，得梅毒螺旋体特异性重组抗原TPN17和TPN47；2)在硝酸纤维素的光滑面上压迹成圆形小孔,作为点样部位，将抗原混合物加至硝酸纤维素膜上的压迹中央，干燥；将点样后的硝酸纤维素膜片浸于奶粉中封闭，将封闭后的硝酸纤维素膜片置于磷酸盐缓冲液中漂洗，得重组抗原包被的硝酸纤维素膜，简称快诊膜，存放于阴晾干燥处备用；3)以人Ig为抗原免疫Balb/c小鼠，通过杂交瘤技术，筛选获得杂交瘤细胞株，稳定分泌抗人Ig单克隆抗体；4)采用过碘酸钠法进行抗人Ig单克隆抗体的辣根过氧化物酶(HRP)标记；5)将步骤2)中得到的重组抗原包被的硝酸纤维素膜沿压迹或划痕剪下，光滑面向上置于聚苯乙烯微量反应板孔中，每孔中加入待检样品50μL,37℃孵育10min；6)将硝酸纤维素膜用磷酸盐缓冲液洗涤，洗涤后弃液体；7)加入50μL步骤4)中辣根过氧化物标记的抗人Ig单克隆抗体,37℃孵育10min，再用磷酸盐缓冲液洗涤，洗涤后弃液体；8)加入显色剂，放置后再用磷酸盐缓冲液洗涤液漂洗，弃液体；9)结果判读，硝酸纤维素膜上斑点呈棕色阳性，无色为阴性。2.如权利要求1所述梅毒螺旋体总抗体Dot-ELISA检测方法，其特征在于在步骤2)中，所述在硝酸纤维素的光滑面上压迹成圆形小孔是采用直径6mm的圆形打孔器在硝酸纤维素的光滑面上压迹成圆形小孔。3.如权利要求1所述梅毒螺旋体总抗体Dot-ELISA检测方法，其特征在于在步骤2)中，所述抗原混合物的用量为0.5μL。4.如权利要求1所述梅毒螺旋体总抗体Dot-ELISA检测方法，其特征在于在步骤2)中，所述奶粉采用质量百分浓度为5％的脱脂奶粉。5.如权利要求1所述梅毒螺旋体总抗体Dot-ELISA检测方法，其特征在于在步骤2)中，所述封闭的时间为30min。6.如权利要求1所述梅毒螺旋体总抗体Dot-ELISA检测方法，其特征在于在步骤2)中，所述磷酸盐缓冲液采用摩尔浓度为0.01mmol/L，pH为7.4的磷酸盐缓冲液；所述漂洗可漂洗3次,每次2min。7.如权利要求1所述梅毒螺旋体总抗体Dot-ELISA检测方法，其特征在于在步骤6)中，所述磷酸盐缓冲液采用350μL摩尔浓度为0.01mmol/L，pH为7.4的磷酸盐缓冲液；所述漂洗可漂洗3次,每次2min。8.如权利要求1所述梅毒螺旋体总抗体Dot-ELISA检测方法，其特征在于在步骤7)中，所述磷酸盐缓冲液采用350μL摩尔浓度为0.01mmol/L，pH为7.4的磷酸盐缓冲液；所述漂洗可漂洗3次,每次2min。9.如权利要求1所述梅毒螺旋体总抗体Dot-ELISA检测方法，其特征在于在步骤8)中，所述显色剂采用3,3-二氨基苯联胺；显色剂的加入量可为50μL；所述3,3-二氨基苯联胺可按50mg3,3-二氨基苯联胺加入摩尔比0.05mol/L的Tris-Hcl缓冲生理盐水100ml配制。10.如权利要求1所述梅毒螺旋体总抗体Dot-ELISA检测方法，其特征在于在步骤8)中，2CN105652006A权利要求书2/2页所述磷酸盐缓冲液可采用350μL摩尔浓度为0.01mmol/L，pH为7.4的磷酸盐缓冲液。3C