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(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN105543156A(43)申请公布日2016.05.04(21)申请号201610119758.6(22)申请日2016.03.02(83)生物保藏信息CGMCCNo.119392015.12.25(71)申请人廊坊梅花生物技术开发有限公司地址065001河北省廊坊市开发区华祥路66号(72)发明人程江红毛贤军刁刘洋(74)专利代理机构北京集佳知识产权代理有限公司11227代理人赵青朵(51)Int.Cl.C12N1/21(2006.01)C12P13/08(2006.01)权利要求书2页说明书8页C12R1/19(2006.01)序列表5页(54)发明名称重组菌株及其制备方法、用途(57)摘要本发明涉及微生物领域,特别涉及重组菌株及其制备方法、用途。本发明以野生型W3110为出发菌株,在其基因组上进行相关改造,无工程质粒负担,对苏氨酸代谢路径中关键基因进行相应的过表达或失活,如强化thrA*BC、敲除tdh,其中thrA*BC的过表达增强了L-苏氨酸生物合成途径,tdh的敲除阻断了L-苏氨酸降解产物甘氨酸的形成。实验结果表明,W3110菌株发酵不产苏氨酸,MHZ-0213-3菌株产苏氨酸为4.2g/L、转化率约8.9%。本发明所述新型大肠杆菌,无质粒负担,构建方法简便且L-苏氨酸产量高于对照菌株,表明其可以应用于L-苏氨酸发酵及后续研究。CN105543156ACN105543156A权利要求书1/2页1.重组菌株,其特征在于,其包含编码突变ThrA蛋白质的突变thrA基因;所述突变ThrA蛋白质具有S345P突变。2.根据权利要求1所述的重组菌株,其特征在于,还包括编码突变Tdh蛋白质的突变tdh基因;所述突变tdh基因为敲除tdh基因。3.根据权利要求1或2所述的重组菌株,其特征在于,还包括过表达突变thrA基因、编码ThrB蛋白质的thrB基因与编码ThrC蛋白质的thrC基因的重组基因;所述突变ThrA蛋白质具有S345P突变。4.根据权利要求1至3任一项所述的重组菌株,其特征在于,其出发菌株为野生型W3110。5.根据权利要求1至4任一项所述的重组菌株,其特征在于,其保藏编号为CGMCCNo.11939。6.根据权利要求1至5任一项所述的重组菌株发酵生产苏氨酸中的应用。7.一种保藏编号为CGMCCNo.11939的L-苏氨酸基因工程生产菌的构建方法,其特征在于,包括如下步骤:以野生型W3110为出发菌株;步骤A、通过在thrA中引入点突变S345P;步骤B、在步骤A构建获得的菌株中敲除tdh基因;步骤C、增加thrA*BC拷贝数。8.一种发酵生产L-苏氨酸的方法,其特征在于,发酵菌株为根据权利要求1至5任一项所述的重组菌株或如权利要求7构建的重组菌株。9.根据权利要求8所述的方法,其特征在于,所述方法为取所述重组菌株活化,在种子培养基中培养后,转接到发酵培养基。10.根据权利要求8或9所述的方法,其特征在于,以g/L计,所述种子培养基包括:所述发酵培养基包括:2CN105543156A权利要求书2/2页3CN105543156A说明书1/8页重组菌株及其制备方法、用途技术领域[0001]本发明涉及微生物领域,特别涉及重组菌株及其制备方法、用途。背景技术[0002]L-苏氨酸是人和动物生长所必需的8种氨基酸之一,其广泛应用于饲料、食品添加及药物辅助材料制备等。目前L-苏氨酸主要通过微生物发酵生产,多种细菌可用于L-苏氨酸生产,如大肠杆菌、棒状杆菌属、沙雷氏菌属等的野生型诱导获得的突变株作为生产菌株。具体实例包括抗氨基酸类似物突变株或甲硫氨酸、赖氨酸、异亮氨酸等多种营养缺陷型(日本专利申请公开号224684/83;韩国专利申请公开号8022/87)[0003]随着全球苏氨酸需求量的不断增加,高产苏氨酸菌株的构建和改造尤为重要。2003年韩国CJ株式会社申请的中国专利CN03811059.8中,利用大肠杆菌,通过缺失苏氨酸操纵子序列的第-56至-18位的39bp序列,增强苏氨酸合成关键基因thrABC表达,苏氨酸生产力提高22%。KwangHoLee(KwangHoLee等,SystemsmetabolicengineeringofEscherichiacoliforL-threonineproduction,MolSystBiol.2007;3:149)等利用系统代谢工程策略,通过突变编码天冬氨酸激酶I和III的基因thrA、lysC解除产物反馈抑制,通过敲除tdh及弱化ilvA来去除副产物甘氨酸、异亮氨酸,通过失活竞争途径基因metA和lysA为苏氨酸合成提供了更多前体等,最终获得的TH28C(pBRThrABCR3)菌株发酵50h可产酸