重组菌株及其制备方法和生产L‑缬氨酸的方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN106520655A(43)申请公布日2017.03.22(21)申请号201611250330.1C12R1/15(2006.01)(22)申请日2016.12.29(83)生物保藏信息CGMCCNo.134062016.11.30(71)申请人廊坊梅花生物技术开发有限公司地址065001河北省廊坊市开发区华祥路66号(72)发明人康培程江红胡丹刁刘洋毛贤军(74)专利代理机构北京集佳知识产权代理有限公司11227代理人赵青朵(51)Int.Cl.C12N1/21(2006.01)权利要求书1页说明书6页C12P13/08(2006.01)序列表2页附图1页(54)发明名称重组菌株及其制备方法和生产L-缬氨酸的方法(57)摘要本发明涉及微生物技术领域，特别涉及重组菌株及其制备方法和生产L-缬氨酸的方法。该重组菌株以棒状杆菌为出发菌株进行改造，其改造包括：将ilvN基因进行点突变和敲除avtA基因。本发明对缬氨酸代谢路径中的ilvN进行点突变，将编码转氨酶的avtA基因敲除，得到重组菌株，经发酵培养，L-缬氨酸的产量可达到12.2g/L，且大大减少了副产物丙氨酸的生成。CN106520655ACN106520655A权利要求书1/1页1.一种重组菌株，其特征在于，以棒状杆菌为出发菌株进行改造，其改造包括：将ilvN基因进行点突变和敲除avtA基因。2.根据权利要求1所述的重组菌株，其特征在于，所述点突变为：将乙酰羟酸合成酶的第20位的甘氨酸被天冬氨酸替代，第21位的异亮氨酸被天冬氨酸替代，以及第22位的异亮氨酸被苯丙氨酸替代。3.根据权利要求1或2所述的重组菌株，其特征在于，所述出发菌株为棒状杆菌ATCC14067。4.根据权利要求1至3中任一项所述的重组菌株，其特征在于，所述重组菌株的保藏编号为CGMCCNo.13406。5.一种重组菌株的构建方法，其特征在于，包括：以棒状杆菌为出发菌株进行改造，其改造包括：将ilvN基因进行点突变和敲除avtA基因。6.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，所述改造采用sacB方法对棒状杆菌基因组进行遗传改造。7.一种生产L-缬氨酸的方法，其特征在于，采用如权利要求1至4中任一项所述的重组菌株或如权利要求5或6所述构建方法构建得到的重组菌株为发酵菌株。8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述生产L-缬氨酸的方法为：将重组菌株接种到种子活化培养基进行活化，然后接种到种子培养基进行种子培养，最后接种到发酵培养基进行发酵培养。9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，以质量百分含量计，所述种子活化培养基包括：酵母提取物1％，蛋白胨1％，氯化钠0.5％，葡萄糖0.5％，琼脂2％，pH7.2；所述种子培养基包括：玉米浆2.5％，葡萄糖1.0％，硫酸铵0.4％，硫酸镁0.04％，磷酸二氢钾0.1％，尿素0.1％，CaCO30.5％，pH7.2；所述发酵培养基包括：玉米浆0.5％，葡萄糖12.0％，硫酸铵4.0％，硫酸镁0.04％，磷酸二氢钾0.1％，CaCO34％，VH50μg/L，VB1·HCl100μg/L，pH7.2。10.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于，所述种子培养的温度为33℃，转速为220r/min，时间为16～22h；所述发酵培养的温度为33℃，转速为220r/min，时间为72h。2CN106520655A说明书1/6页重组菌株及其制备方法和生产L-缬氨酸的方法技术领域[0001]本发明涉及微生物技术领域，特别涉及重组菌株及其制备方法和生产L-缬氨酸的方法。背景技术[0002]L-缬氨酸(L-valine)，化学名称为L-α-氨基异戊酸，分子式为C5H11NO2，相对分子质量为117.15。呈白色结晶或结晶性粉末，无臭，味苦，在水中溶解度：25℃为88.5g/L，50℃为96.2g/L，不溶于冷乙醇，乙醚，丙酮。等电点为5.96，熔点315℃。L-缬氨酸是人体八种必需氨基酸之一，又是三种支链氨基酸(包括缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸)之一，因其特殊的结构和功能，在人类生命代谢中具有特别重要的地位。可以广泛应用于医药工业、食品工业和饲料工业等。医药工业中，可作氨基酸输液、综合氨基酸制剂的主要成分，可治疗肝功能衰竭、中枢神经系统功能紊乱，如缺乏可引起神经障碍、停止发育、体重下降、贫血等。食品工业中，可用作食品添加剂、营养增补液及风味剂等；米制糕饼中添加缬氨酸(1g/kg)，产品有芝麻香，用于面包亦能改善风味；L-缬氨酸也可用作氨基酸功能性饮料与运动员饮料，有形成肌肉、强化肝功能、减轻肌肉疲劳等作用。饲料工业中，对动物的乳腺组织分泌乳汁有重要的促进作用，将其用于雏鸡饲料中，可提高雏鸡对鸡新城疫病毒的免