基于美洲大蠊Dsx基因设计的dsRNA、其制备方法、编码基因及应用.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN110551720A(43)申请公布日2019.12.10(21)申请号201910744841.6(22)申请日2019.08.13(71)申请人梅州市华师昆虫发育生物学与应用技术重点实验室广梅园研发中心地址514000广东省梅州市高新区高新二路1号广梅绿色创新中心9号楼申请人华南师范大学(72)发明人李胜朱仕明(74)专利代理机构广州嘉权专利商标事务所有限公司44205代理人肖云(51)Int.Cl.C12N15/113(2010.01)A01N57/16(2006.01)A01P7/04(2006.01)权利要求书1页说明书7页序列表3页附图5页(54)发明名称基于美洲大蠊Dsx基因设计的dsRNA、其制备方法、编码基因及应用(57)摘要本发明公开了基于美洲大蠊Dsx基因设计的dsRNA、其制备方法、编码基因及应用，所述dsRNA为由如SeqIDNo.1所示的核苷酸序列作为正义链及由与SeqIDNo.1所示的核苷酸序列反向互补的核苷酸序列作为反义链组成的双链RNA。所述dsRNA可广泛应用于制备防治美洲大蠊、干扰美洲大蠊化学通讯或控制美洲大蠊雌性成虫生殖的产品或防控美洲大蠊及其他具有相同基因靶标序列的昆虫中。以昆虫性别决定基因Dsx为靶标，基于Dsx中的基因片段设计一种dsRNA，将该dsRNA导入到成年雌性美洲大蠊体内，抑制其卵子发生和卵巢成熟，从而控制雌性美洲大蠊的生殖，达到害虫防控的目的。CN110551720ACN110551720A权利要求书1/1页1.基于美洲大蠊Dsx基因设计的dsRNA，其特征在于：所述dsRNA为由如SeqIDNo.1所示的核苷酸序列作为正义链及由与SeqIDNo.1所示的核苷酸序列反向互补的核苷酸序列作为反义链组成的双链RNA。2.如权利要求1所述的dsRNA的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：将核苷酸序列如SeqIDNo.3所示的DNA片段克隆到载体中，基于克隆后的载体设计引物并进行PCR扩增后，将PCR扩增产物转录合成即得。3.编码如权利要求1所述的dsRNA的基因。4.如权利要求3所述的基因的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：基于上述基因设计启动子引物对，进行PCR扩增即得。5.含有如权利要求3所述的基因的表达载体、表达盒、转基因细胞系或宿主菌。6.如权利要求1所述的dsRNA在制备用于防治美洲大蠊或控制美洲大蠊雌性成虫生殖的产品中的应用。7.如权利要求1所述的dsRNA在防控美洲大蠊及其他具有相同基因靶标序列的昆虫生殖中的应用。8.一种防控美洲大蠊的方法，其特征在于：包括以下步骤：将如权利要求1所述的dsRNA导入到美洲大蠊雌虫体内。9.根据权利要求8所述的防控美洲大蠊的方法，其特征在于：所述导入操作通过注射的方式；优选地，所述注射操作是从沿腹部第二体节注入。10.根据权利要求8所述的防控美洲大蠊的方法，其特征在于：导入操作是在羽化后的第2、4和6天分别注射dsRNA一次。2CN110551720A说明书1/7页基于美洲大蠊Dsx基因设计的dsRNA、其制备方法、编码基因及应用技术领域[0001]本发明涉及卫生害虫防治领域，具体涉及基于美洲大蠊Dsx基因设计的dsRNA、其制备方法、编码基因及应用。背景技术[0002]1965年，在果蝇中发现了一种使后代的雄性和雌性发育为中间性的隐性突变，这个突变体被称为doublesex(Dsx)[1]。研究表明，Dsx基因通过其转录本性别特异性的选择性剪接产生一种雄性和一种雌性特异性DSX蛋白，发挥其体细胞性分化中的双功能作用，从而调控下游与性别特异性特征相关的靶基因[2]。Dsx曾被认为是所有昆虫性别决定级联中的最终主调控基因，然而，后来的研究否定了这一说法，认为它是性别决定和性别分化之间的中枢联系[3]。Dsx同源基因在不同昆虫物种中具有不同数量，例如双翅目昆虫具有多个，膜翅目昆虫有两个，而在鳞翅目昆虫中只有一个。Dsx具有多种末端调控功能，包括调节翅型大小、拟态、性二型性、行为以及荷尔蒙分泌等，而生殖过程中，Dsx能调控卵黄生成，表明Dsx在生殖调控中具有重要作用[4]。在琥珀蚕(Antheraeaassama)中，RNAi介导Dsx沉默完全抑制Vg基因的表达，表明Vg是Dsx的下游靶基因，并且能导致卵巢畸形，生殖力下降和卵的完全致死，揭示了Dsx作为末端调节基因在生殖中的重要性[5]。在赤拟谷盗中，Vg及其受体基因VgR(Vitellogeninreceptors)被鉴定为Dsx的靶标基因，DsxRNAi导致这两个基因的表达下调，卵子发生受到抑制，产卵率和卵的孵化率显著降低[6]。[0003]美洲大蠊(Periplanetaamericana)属蜚蠊目