快速检测东方蜜蜂微孢子虫的RPA-LFD引物、方法和试剂盒.pdf

(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN115029463A(43)申请公布日2022.09.09(21)申请号202210676399.X(22)申请日2022.06.15(71)申请人中国农业科学院蜜蜂研究所地址100093北京市海淀区香山北沟1号(72)发明人杨卅邓炎春侯春生代平礼(74)专利代理机构北京惟诚致远知识产权代理事务所(普通合伙)11536专利代理师王慧凤(51)Int.Cl.C12Q1/6893(2018.01)C12Q1/6844(2018.01)C12Q1/6804(2018.01)C12N15/11(2006.01)C12R1/90(2006.01)权利要求书1页说明书6页序列表1页附图2页(54)发明名称快速检测东方蜜蜂微孢子虫的RPA-LFD引物、方法和试剂盒(57)摘要本发明公开了一种快速检测东方蜜蜂微孢子虫(Nosemaceranae)的RPA‑LFD引物、方法和试剂盒，该引物序列表中序列3所示的核苷酸和序列表中序列4所示的核苷酸组成，该探针序列如序列表中序列5所示。本发明准确性高、特异性好、重复性好、可以准确、快速地进行检测，反应结果易于观察，通过试纸条的红色条带即可判读；灵敏度高；特异性好，适用于蜂场的现场检测等，具有极高的应用价值。CN115029463ACN115029463A权利要求书1/1页1.一种快速检测东方蜜蜂微孢子虫的RPA‑LFD引物，由正向引物和反向引物组成，所述正向引物的核苷酸序列如SEQIDNO：3所示，所述反向引物的核苷酸序列如SEQIDNO：4所示。2.根据权利要求1所述的RPA‑LFD引物，其特征在于，所述的反向引物的5′端用生物素Biotin标记。3.一种快速检测东方蜜蜂微孢子虫的RPA‑LFD探针，其核苷酸序列如SEQIDNO：5所示。4.根据权利要求3所述的RPA‑LFD探针，其特征在于，探针的5’端标记了FAM或FITC荧光基团，3’端用C3Spacer封闭。5.一种快速检测东方蜜蜂微孢子虫的RPA‑LFD试剂盒，其特征在于，该试剂盒中包含权利要求1或2所述的RPA‑LFD引物和权利要求3或4所述的RPA‑LFD探针。6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，该试剂盒中还含有浓度为280mM的醋酸镁溶液和反应缓冲液RehydrationBuffer、拥挤剂Carbowax20M、dNTPs、ATP、磷酸肌酸、肌酸激酶、重组酶蛋白、单链结合蛋白、DNA聚合酶和RPA‑LFD核酸检测试纸条。7.一种快速检测东方蜜蜂微孢子虫的RPA‑LFD方法，其特征在于，包含以下步骤：1)提取样本核酸；2)以提取的核酸为模板，用权利要求1或2所述的引物，以及权利要求3或4所述探针进行RPA反应；3)将上述反应得到的RPA反应产物用无菌水稀释，得到稀释液；4)将稀释液滴在RPA‑LFD核酸检测试纸条上，确定样品中是否含有东方蜜蜂微孢子虫；其中，RPA‑LFD核酸检测试纸条可检测RPA反应产物是否携带荧光标记和生物素Biotin标记。8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：步骤(2)中的RPA反应体系为：RehydrationBuffer29.5uL，20umol/L的权利要求1或2所述的RPA‑LFD引物中的正向引物和反向引物各2.1uL，10umol/L的权利要求3或4所述的RPA‑LFD探针0.6uL，样本核酸2.0uL，280mM醋酸镁2.5uL，H2O补至50uL。9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤(2)中的RPA反应条件为：39‑42℃反应20‑30min。2CN115029463A说明书1/6页快速检测东方蜜蜂微孢子虫的RPA‑LFD引物、方法和试剂盒技术领域[0001]本发明涉及生物技术领域，具体而言，本发明涉及一种快速检测东方蜜蜂微孢子虫的RPA‑LFD引物、方法和试剂盒。背景技术[0002]东方蜜蜂微孢子虫病的病原属于微孢子虫科(Nosematidae)微孢子虫属(Nosema)的成员，被命名为东方蜜蜂微孢子虫。东方蜜蜂微孢子虫属于单细胞真核生物，不能在宿主细胞外繁殖，没有经典的线粒体，但携带有由线粒体衍生的细胞器，称为线粒体残迹，通过利用宿主的能量物质完成自身的快速繁殖。东方蜜蜂微孢子虫具有感染蜂种多、范围广的特点。[0003]对蜜蜂孢子虫病病原的检测方法有，通过拉取蜜蜂中肠，然后用普通光学显和相差显微镜观察孢子虫(根据孢子大小)，以超微结构中的极丝的螺旋数、直径和孢子大小。用流式细胞仪定量检测活性孢子；用普通PCR和qPCR检测感染率。在养蜂生产中，根据观察蜜蜂感染后的中肠的病变形态等临床症状及用光学显微镜方法诊断，结果均相对滞后且不可靠、检测率低；电镜鉴定方法需要较高的专门操作技术和精密仪器，PCR检测也需要昂贵