空肠弯曲菌的实时荧光定量PCR检测方法及试剂盒.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局*CN101886133A*(12)发明专利申请(10)申请公布号CNCN101886133101886133A(43)申请公布日2010.11.17(21)申请号201010241090.5G01N21/64(2006.01)(22)申请日2010.07.29(71)申请人高正琴地址100068北京市丰台区西马场南里7号西马·金润家园一区16号楼4单元1101室(72)发明人高正琴(74)专利代理机构北京尚诚知识产权代理有限公司11322代理人鲁兵(51)Int.Cl.C12Q1/68(2006.01)C12Q1/06(2006.01)C12N15/11(2006.01)权利要求书1页说明书8页序列表2页附图2页(54)发明名称空肠弯曲菌的实时荧光定量PCR检测方法及试剂盒(57)摘要本发明公开了一种空肠弯曲菌的实时荧光定量PCR检测方法及试剂盒。所述引物和TaqMan探针，是根据空肠弯曲菌鞭毛蛋白A(flaA)基因保守区域的保守区域设计的，用以定量检测临床病人粪便样本、猴、犬粪便样本以及小型猪回盲部内容物样本中空肠弯曲菌的核酸拷贝数，上游引物序列SEQIDNO：1，下游引物序列SEQIDNO：2；TaqMan探针序列SEQIDNO：3。本发明对控制人和动物源性相关生物制品的质量及进出口动物检验检疫领域中有具有较大的实际意义，能够保证相关生物制品的质量。本发明的检测方法及试剂盒可用于弯曲菌病的诊断及生物制品的空肠弯曲菌检定，应用前景广阔。CN10863ACN101886133ACCNN110188613301886134A权利要求书1/1页1.用于对空肠弯曲菌进行实时荧光定量PCR检测的引物和TaqMan探针，是根据空肠弯曲菌鞭毛蛋白A(flaA)基因保守区域的保守区域设计的，用以定量检测临床病人粪便样本、猴、犬粪便样本以及小型猪回盲部内容物样本中空肠弯曲菌的核酸拷贝数。2.根据权利要求1所述的引物和TaqMan探针，其特征在于：所述引物的上游引物具有序列表中SEQIDNO：1的核苷酸序列，下游引物具有序列表中SEQIDNO：2的核苷酸序列；所述TaqMan探针具有序列表中SEQIDNO：3的核苷酸序列。3.根据权利要求2所述的引物和TaqMan探针，其特征在于：所述TaqMan探针为经过荧光标记的，其5’端标记有报告荧光基团，3’端标记有淬灭荧光基团。4.根据权利要求3所述的引物和TaqMan探针，其特征在于：所述报告荧光基团为FAM，荧光淬灭基团为NFQ。5.一种空肠弯曲菌的实时荧光定量PCR检测方法，是以权利要求1-4任一项所述的引物和TaqMan探针进行的实时荧光定量PCR检测方法。6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于：所述20μL实时荧光定量PCR反应体系包括：TaqMan探针+引物1μL(TaqMan探针浓度250nM，上、下游引物浓度各为900nM)，样品cDNA1μL(1μg/mL)，无RNA酶水8μL，TaqmanMix(TaqManGeneExpressionMasterMix4369016，购自美国应用系统(ABI)公司)10μL。7.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于：所述实时荧光定量PCR反应条件为：先50℃2min；然后95℃10min；最后95℃15sec，60℃1min，共40个循环，在每个循环的延伸结束时进行荧光信号检测。8.根据权利要求5或6或7所述的检测方法，其特征在于：所述检测方法还包括标准曲线的建立，方法为：用含空肠弯曲菌鞭毛蛋白A(flaA)基因的重组质粒pMD-CJ-flaA的DNA作为标准品，将其10倍系列稀释成Ⅰ：1.1×1010拷贝/μL；Ⅱ：1.1×109拷贝/μL；Ⅲ：1.1×108拷贝/μL；Ⅳ：1.1×107拷贝/μL；Ⅴ：1.1×106拷贝/μL；Ⅵ：1.1×105拷贝/μL；Ⅶ：1.1×104拷贝/μL；Ⅷ：1.1×103拷贝/μL；Ⅸ：1.1×102拷贝/μL；Ⅹ：1.1×101拷贝/μL；Ⅺ：1.1×100拷贝/μL；各取1μL质粒DNA作为模板DNA，进行实时荧光定量PCR检测，每份样本重复平行试验3次，得到用于空肠弯曲菌检测的标准曲线。9.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于：所述标准曲线的20μL实时荧光定量PCR反应体系包括：TaqMan探针+引物1μL(TaqMan探针浓度250nM，上、下游引物浓度各为900nM)，质粒DNA1μL(0.0003219mg/mL)，无RNA酶水8μL，TaqmanMix(TaqManGeneExpressionMasterMix4369016，购自美国应用系统(ABI)公司)10μL；实时荧光定量PCR反应条件与权利要求7相同。10.一种用于对空肠弯曲菌进行实