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(19)中华人民共和国国家知识产权局*CN102220255A*(12)发明专利申请(10)申请公布号CN102220255A(43)申请公布日2011.10.19(21)申请号201010151996.8A61P31/10(2006.01)(22)申请日2010.04.14A61P31/12(2006.01)A61P33/02(2006.01)(71)申请人深圳市圣西马生物技术有限公司A61P35/00(2006.01)地址518057广东省深圳市南山区高新中四C12R1/865(2006.01)道31号研祥科技大厦10楼B1-B2单元(72)发明人彭永鹤李永新林美娟(51)Int.Cl.C12N1/19(2006.01)C12N15/12(2006.01)C12N15/81(2006.01)C07K14/47(2006.01)A23K1/16(2006.01)A23L3/3526(2006.01)A01N63/04(2006.01)A61K38/17(2006.01)A01P1/00(2006.01)A01P3/00(2006.01)A61P31/04(2006.01)权利要求书1页说明书6页序列表1页附图4页(54)发明名称一种重组抗菌肽及其基因工程制备方法和应用(57)摘要本发明提供一种重组抗菌肽工程菌的制备方法及其应用,属于生物基因工程技术领域,包括抗菌肽基因的扩增,基因克隆,啤酒酵母转化,重组蛋白的高效表达和纯化。本发明的重组抗菌肽为猪源抗菌肽Cathelicidins家族PAMP-36,其蛋白含有如序列工DNo.2所示的短肽。本发明制得的重组抗菌肽可用于生产饲料添加剂、兽药、防腐剂,以及用于制备革兰氏阴性菌,革兰氏阳性菌,真菌或病毒感染引发的疾病的药物。CN1025ACCNN110222025502220264A权利要求书1/1页1.重组抗菌肽PMAP-36的工程菌以及产物的制备方法,其特征在于其操作步骤为:A.PMAP-36基因的获得和扩增:参照LS(Invitrogen)试剂盒说明书,从母猪的股骨骨髓中提取基因组RNA。在人工合成引物的存在下,通过RT-PCR获得编码PMAP-36的基因片段。B.基因克隆和转化大肠杆菌:回收PCR产物,用T4连接酶与PMD18-T载体连接。转化大肠杆菌TOP10感受态细胞,经抗性培养基筛选后,获得具有正确编码序列的PMAP-36基因。C.酿酒酵母表达载体构建和转化:分别用限制性内切酶XbaI和HindIII双酶切重组质粒和酵母穿梭质粒pVT102U/α。回收酶切产物,用T4DNA连接酶连接,构建重组表达质粒PVT-PMAP36,用电转的方法转入酿酒酵母S78,获得阳性转化子S78-PMAP36。D.将工程菌扩大培养,纯化蛋白:2.如权利要求1中所述的方法,其特征在于步骤A中,在合成的上游引物中引入XbaI酶切位点,在合成的下游引物中引入HindIII酶切位点。其合成的引物序列为:S1:5′-CCGAGATCTATGGAGACCCAGAGGGCCAGCC-3′F1:5′-GGGTTCGAATTACCCACAACCCAAGGGTATTG-3′3.如权利要求1所述,其特征在于步骤B中的抗性培养基含有氨苄青霉素。4.如权利要求1所述的方法,其特征在于在酵母表达载体的多克隆位点间插入抗菌肽PMAP-36基因,其表达框为ADH1-MFα-抗菌肽PMAP-36-TT,其中ADH1为启动子,α是α因子信号肽序列,TT是终止子。5.如权利要求1所述,其特征在于步骤C中电转的步骤为:将80μl酵母细胞感受态细胞与5~10μl重组质粒PVT-PMAP36混合均匀,转入到冰预冷的0.2cm电转槽中,将混合液在冰上放置5min;1500V,5ms电击,然后加入1ml恢复培养液,于30℃培养箱中培养2h;将培养液涂布于筛选培养基(SCR)中,30℃培养至单菌落出现。6.如权利要求1所述的方法,其特征在于步骤D中工程菌的纯化,具体步骤为:挑取高效阳性转化子S78-PMAP36,在YPD(1%酵母抽提物,2%蛋白胨,2%葡萄糖)液体培养基中扩大培养,当OD600=2-6时,收集菌液,离心取上清。用CM-cellulose23柱层析,收集蛋白组分,冷冻干燥,获得重组PMAP36蛋白。7.权利要求4~6任选一项的方法在生产制备抗菌肽饲料添加剂、食品保鲜、农作物病害防治以及医药产品中的应用。2CCNN110222025502220264A说明书1/6页一种重组抗菌肽及其基因工程制备方法和应用【技术领域】[0001]本发明属于生物基因工程技术领域,具体地说涉及一种重组抗菌肽,其基因工程菌制备方法及应用。【背景技术】[0002]目前,抗菌肽(antimicrobial/antibacterialpeptides,AM