一种解淀粉芽孢杆菌Q-426及其脂肽的分离方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN105331562A(43)申请公布日2016.02.17(21)申请号201510873816.XC07K1/18(2006.01)(2006.01)(22)申请日2015.12.02C07K1/16C12R1/07(2006.01)(83)生物保藏信息CCTCCNO:M20102372010.09.17(71)申请人大连民族大学地址116600辽宁省大连市经济技术开发区辽河西路18号(72)发明人权春善金黎明郑维周伟刘静范圣第(74)专利代理机构大连智高专利事务所(特殊普通合伙)21235代理人胡景波(51)Int.Cl.C12N1/20(2006.01)C07K1/30(2006.01)权利要求书1页说明书6页附图3页(54)发明名称一种解淀粉芽孢杆菌Q-426及其脂肽的分离方法(57)摘要本发明涉及微生物代谢产物技术领域，具体为一种解淀粉芽孢杆菌Q-426及其脂肽的分离方法，解淀粉芽孢杆菌Q-426易培养，对营养要求不高，在很宽的温度及pH值范围内均能很好地生长，具有广谱的抗真菌活性，对多种肿瘤细胞具有较强的抑制作用；脂肽的分离方法主要包括：发酵培养、酸沉淀、清洗、抽提、浓缩、阳离子交换树脂吸附、色谱层析树脂吸附与解吸、半制备型高效液相色谱仪收集八个步骤。本发明构建了一套多种脂肽组分同步分离的方法，该方法较以前的活性炭吸附法、大孔树脂吸附法及柱层析法有着明显的优点，能够获得单一组分，且纯度、收率均较高，纯化所需时间明显缩短。CN105331562ACN105331562A权利要求书1/1页1.一种解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)Q-426，其特征在于，保藏编号为CCTCCNO.M2010237。2.一种如权利要求1所述解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)Q-426脂肽的分离方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)发酵培养：解淀粉芽孢杆菌经活化、一级种子培养、发酵后，得发酵液；(2)酸沉淀：发酵液离心去除菌体，取上清液，将上清液调pH至2.0-3.0进行酸沉淀，离心得沉淀；(3)清洗：使用超纯水清洗步骤(2)所得沉淀；(4)抽提:使用100wt％甲醇重悬步骤(3)清洗后的沉淀,离心留上清液；(5)浓缩：将步骤(4)所得上清液浓缩，得粗提样Ⅰ；(6)吸附：向阳离子交换树脂的层析柱中加入粗提样Ⅰ，用50wt％甲醇溶液洗脱；将流出液蒸发去除甲醇，调pH至2.0-3.0,离心去除上清液留沉淀，将沉淀用超纯水溶解,得粗提样Ⅱ；(7)吸附与解吸：向色谱层析树脂中加入粗提样Ⅱ，静态吸附7-10h；将吸附了粗提样Ⅱ的色谱层析树脂进行装柱，用40-60wt％甲醇溶液洗脱后；再用80-100wt％甲醇溶液洗脱，收集洗脱液；将洗脱液蒸干后，用超纯水溶解，得粗提样Ⅲ；(8)半制备型高效液相色谱仪收集：将粗提样Ⅲ使用半制备型高效液相色谱按峰收集纯化，从而实现脂肽的分离。3.如权利要求2所述分离方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)发酵培养：解淀粉芽孢杆菌经活化、一级种子培养、发酵后，得发酵液；(2)酸沉淀：发酵液离心去除菌体，取上清液，将上清液调pH至2.0进行酸沉淀，离心得沉淀；(3)清洗：使用超纯水清洗步骤(2)所得沉淀；(4)抽提:使用100wt％甲醇重悬步骤(3)清洗后的沉淀,离心留上清液；(5)浓缩：将步骤(4)所得上清液于42℃蒸发浓缩，得粗提样Ⅰ；(6)吸附：向阳离子交换树脂的层析柱中加入粗提样Ⅰ，用50wt％的甲醇溶液以3BV/h的流速冲洗树脂；将流出液蒸发去除甲醇，调pH至2.0,离心去除上清液留沉淀，将沉淀用超纯水溶解,得粗提样Ⅱ；(7)吸附与解吸：向色谱层析树脂中加入粗提样Ⅱ，置于4℃，100rpm静态吸附8h；将吸附了粗提样Ⅱ的色谱层析树脂进行装柱，用50wt％甲醇溶液以6BV/h的流速洗脱；再用90wt％甲醇溶液以3BV/h的流速洗脱，收集洗脱液；将洗脱液蒸干后，用超纯水溶解，得粗提样Ⅲ；(8)半制备型高效液相色谱仪收集：将粗提样Ⅲ使用半制备型高效液相色谱按峰收集纯化，色谱柱为C18，检测波长为220nm,从而实现脂肽的分离。2CN105331562A说明书1/6页一种解淀粉芽孢杆菌Q-426及其脂肽的分离方法技术领域[0001]本发明涉及解淀粉芽孢杆菌Q-426及其脂肽的分离方法，属于微生物代谢产物技术领域。背景技术[0002]解淀粉芽孢杆菌是芽孢杆菌属的一个种，具有较强的次级代谢产物生产能力，可以产生多种具有生物活性的代谢产物，脂肽是其中一种重要的代谢产物，是由短肽和脂肪酸链组成的两性分子：多个氨基酸组成的肽链形成亲水基，脂肪烃链形成亲油基。由于其特殊的化学结构，脂肽物质具有