一种解淀粉芽孢杆菌制备环二肽的方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局*CN102061325A*(12)发明专利申请(10)申请公布号CN102061325A(43)申请公布日2011.05.18(21)申请号201010563817.1C12R1/07(2006.01)(22)申请日2010.11.29(71)申请人大连民族学院地址116600辽宁省大连市经济技术开发区淮河西路118号(72)发明人权春善赵鹏超王建华范圣第(74)专利代理机构大连星海专利事务所21208代理人于忠晶(51)Int.Cl.C12P21/02(2006.01)权利要求书1页说明书3页附图3页(54)发明名称一种解淀粉芽孢杆菌制备环二肽的方法(57)摘要本发明涉及环二肽的制法，特别是从微生物中分离纯化制得环二肽-cyclo(Phe-Pro)的方法。环二肽-cyclo(Phe-Pro)，其结构为：，式中英文缩写表示：cyclo环、Phe苯丙氨酸、Pro脯氨酸。采用粗提液制备、环二肽的初步分离纯化和环二肽的精制三步骤获得。本发明通过对培养基中影响环二肽合成的氮源、碳源、无机盐离子及其含量和培养温度、时间、通气速率等各个因素选取几个水平，采用单因素实验，最终提供了适合环二肽合成最佳的水平。CN102635ACCNN110206132502061331A权利要求书1/1页1.环二肽-cyclo(Phe-Pro)，其结构为：式中英文缩写表示：cyclo环、Phe苯丙氨酸、Pro脯氨酸。2.一种解淀粉芽孢杆菌制备权利要求1所述环二肽的方法，其特征是：包括粗提液制备、环二肽的初步分离纯化和环二肽的精制三步骤：第一步：粗提液的制备：将于斜面保存的解淀粉芽孢杆菌Q426进行发酵培养一段时间后，将发酵液分装到离心管中，4℃，8000rpm离心20min，弃净沉淀得到不含菌体的发酵液上清，将发酵液上清用旋转蒸发仪浓缩至一定体积，其间必要时进行离心，以免菌体污染，将浓缩液通过0.22μm无菌微孔滤膜两次以达到彻底除菌的目的，取适量倒入分液漏斗中，再加入等体积的乙酸乙酯，充分颠倒混匀，静置30min，以使两相分层明显且将目的物充分地被萃取至上层的有机相中，流出下层液，弃去中间的脂蛋白层，倒出上层液，下层的发酵液重复萃取一次，将收集的上层液于旋转蒸发仪中低温挥发掉乙酸乙酯，最终用一定体积的100％乙腈溶解沉淀，所得溶液在4℃，12,000rpm下，离心20min，立即吸出上清，待用；第二步：环二肽的初级分离纯化：主要通过采用两次硅胶柱层析，得到的各洗脱溶液，做GC-MS，与标准品进行比对，从中找出哪管洗脱液中含有环二肽，待用；第三步：环二肽的精制：将待测液和标准品进行高效液相色谱分析，根据标准品的谱图，收集目的产物，最终检测环二肽的纯度。3.根据权利要求2所述的一种解淀粉芽孢杆菌制备环二肽的方法，其特征是：第一步中解淀粉芽孢杆菌Q426进行发酵培养采用的氮源：胰蛋白胨、酵母粉、尿素或无机氮；碳源：葡萄糖含量（1%-3%W/V）；无机盐：氯化镁、硫酸亚铁、硫酸锰、磷酸氢二钾和氯化钠等；发酵条件：温度：28~37℃；摇床转速：180rpm、190rm、200rpm、210rpm和220rpm；培养时间：24h、48h、60h、66h、72h、75h、78h、84h、90h、96h、102h、108h和120h。4.根据权利要求2或3所述的一种解淀粉芽孢杆菌制备环二肽的方法，其特征是：第一步中解淀粉芽孢杆菌Q426进行发酵培养条件：胰蛋白胨，葡萄糖含量2%W/V，无机盐氯化镁、硫酸亚铁、硫酸锰、磷酸氢二钾和氯化钠，培养温度30℃，摇床转速200rpm，培养时间75h。2CCNN110206132502061331A说明书1/3页一种解淀粉芽孢杆菌制备环二肽的方法技术领域[0001]本发明涉及环二肽的制法，特别是从微生物中分离纯化制得环二肽-cyclo(Phe-Pro)的方法。背景技术[0002]环二肽在自然界及天然产物中广泛存在，环二肽又称为2,5-二酮哌嗪衍生物，从结构来看，其特征在于都具有由两个氨基酸通过肽键连接而形成的一个稳定的六元环，由于其结构的特殊性，故成为药物化学中一个重要的药效基团，许多环二肽具有较强的生理和药理活性。研究者不断地从人和其它生物中分离出种类繁多，功能各异的环二肽。在已发现的天然环二肽中，只有约十种氨基酸或其衍生物参与。[0003]目前，由于环二肽的研究还处于理论阶段，工业上批量生产，还未出现，只是发现有化学合成的，但由于成本高及带来的环境问题，使得理论和实际应用起来很不方便。发明内容[0004]本发明的目的是克服上述不足问题，提供一种解淀粉芽孢杆菌制备环二肽的方法，从微生物中提取分离得到的天然环二肽，最后经过纯化，结构鉴定为cyclo(Phe-Pro)，具有绿色性，环二肽生产条件优化