一种酶法制备奥利司他中间体的方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN109022473A(43)申请公布日2018.12.18(21)申请号201810917366.3(22)申请日2018.08.13(71)申请人浙江海洋大学地址316100浙江省舟山市普陀区普陀海洋科技产业园普陀展茅晓辉工业区c2—10地块(72)发明人唐云平周亚峰丁国芳余方苗杨最素黄芳芳陈艳(74)专利代理机构杭州杭诚专利事务所有限公司33109代理人尉伟敏(51)Int.Cl.C12N15/70(2006.01)C12N9/04(2006.01)C12P17/02(2006.01)权利要求书2页说明书5页序列表2页(54)发明名称一种酶法制备奥利司他中间体的方法(57)摘要本发明涉及医药技术领域，公开了一种酶法制备奥利司他中间体的方法，包括短链醇脱氢酶原始基因的合成、短链醇脱氢酶的表达、细胞破碎及酶催化等步骤，利用短链醇脱氢酶催化法制备高手性ee值(ee＞99%)的奥利司他中间体（R）-3-羟基-十四烷酸甲酯，以替代传统的化学合成方法，减少生产成本及对环境的污染。本发明提供的奥利司他中间体的合成方法，反应条件更温和，反应速度更快，反应收率和手性ee值高，且生产成本低，适合工业扩大化生产。CN109022473ACN109022473A权利要求书1/2页1.一种酶法制备奥利司他中间体的方法，其特征在于包括以下步骤：（1）短链醇脱氢酶原始基因的合成：按照大肠杆菌密码子分析用表对短链醇脱氢酶NA-ADH原始基因序列进行密码子优化，得到优化后的NA-ADH基因序列，对其进行目的基因的全合成，合成后的全基因两端分别带有NdeI和XhoI酶切位点并连接到pET26b(+)上，获得重组表达载体pET26b-NA-ADH，优化后的NA-ADH基因序列如SEQIDNO.1所示，其编码的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示；（2）短链醇脱氢酶的表达：将重组表达载体pET26b-NA-ADH通过热激转化法转到表达菌株BL21(DE3)中，挑取单菌落，将单菌落接入到含卡那霉素的LB培养液中培养，然后添加IPTG，诱导培养过夜；（3）细胞破碎：将培养好的菌株离心，收集菌体，重悬菌体后对其进行超声破碎，所得液体即为含重组短链醇脱氢酶菌体破碎液；（4）酶催化：将β-羰基十四烷酸甲酯加入反应器中，随后，将NAD+、含重组短链醇脱氢酶菌体破碎液、含重组葡萄糖脱氢酶菌体破碎液、葡萄糖、磷酸盐缓冲液的混合溶液加入反应器中，进行反应。2.如权利要求1所述的一种酶法制备奥利司他中间体的方法，其特征在于：步骤（2）中，将所述单菌落接入到3~7mL含浓度为49~51μg/mL卡那霉素的LB培养液中，在36~38℃条件下振荡培养6~12h，得菌种液；每1mL菌种液加入到含浓度为49~51μg/mL卡那霉素的100mLTB培养基中，36~38℃下振荡培养至OD600至2.8~3.2，然后添加IPTG至IPTG的终浓度为0.05~0.15mM，20~30℃下诱导培养6~12h。3.如权利要求1或2所述的一种酶法制备奥利司他中间体的方法，其特征在于：步骤（2）中，所述LB培养液中含有以下成分的物质：每1LLB培养液中含有蛋白胨5~15g、酵母提取物2~8g、NaCl5~15g，余量为去离子水。4.如权利要求3所述的一种酶法制备奥利司他中间体的方法，其特征在于：步骤（2）中，所述LB培养液中含有以下成分的物质：每1LLB培养液中含有蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl10g，余量为去离子水。5.如权利要求1或2所述的一种酶法制备奥利司他中间体的方法，其特征在于：步骤（2）中，所述TB培养基中含有以下成分的物质：每1LTB培养液中含有蛋白胨10~15g、酵母提取物20~28g、甘油2~6mL、KH2PO42~2.7g、K2HPO412~13g，余量为去离子水。6.如权利要求5所述的一种酶法制备奥利司他中间体的方法，其特征在于：步骤（2）中，所述TB培养基中含有以下成分的物质：每1LTB培养液中含有蛋白胨12g、酵母提取物24g、甘油4mL、KH2PO42.31g、K2HPO412.54g，余量为去离子水。7.如权利要求6所述的一种酶法制备奥利司他中间体的方法，其特征在于：所述培养基的制备方法为：将蛋白胨、酵母提取物、甘油加入900~950mL去离子水中，制成溶液A；将KH2PO4、K2HPO4溶于50~100mL去离子水中，制成溶液B；将溶液A和溶液B分别灭菌后冷却至20~60℃混合均匀。8.如权利要求1所述的一种酶法制备奥利司他中间体的方法，其特征在于：步骤（3）中，所述离心机的转速为8000~12000r/min，离心时间为8~12min；用浓度为0.05~0.15M、pH为6.8~7.2的磷酸