一种重组大肠杆菌及其构建方法与应用.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN109370970A(43)申请公布日2019.02.22(21)申请号201811344851.2(22)申请日2018.11.13(71)申请人南京工业大学地址210000江苏省南京市浦口区浦珠南路30号(72)发明人陈可泉冯娇李康许晟王昕欧阳平凯(74)专利代理机构南京苏高专利商标事务所(普通合伙)32204代理人肖明芳(51)Int.Cl.C12N1/21(2006.01)C12N15/70(2006.01)C12P7/46(2006.01)C12R1/19(2006.01)权利要求书1页说明书7页序列表6页附图2页(54)发明名称一种重组大肠杆菌及其构建方法与应用(57)摘要本发明公开了一种重组大肠杆菌，其导入了吩嗪-1-羧酸合成基因。还公开了重组大肠杆菌的构建方法及其在制备丁二酸中的应用。重组菌株E.coli-phz丁二酸产量及转化率明显高于原始菌株E.coliK12(△ldhA,△pflB,△ptsG)，以富马酸为碳源，和原始菌株E.coliK12(△ldhA,△pflB,△ptsG)相比，重组菌株E.coli-phz的丁二酸产量提高了68％；以葡萄糖为碳源，和原始菌株E.coliK12(△ldhA,△pflB,△ptsG)相比，重组菌株E.coli-phz的质量收率提高了26％。CN109370970ACN109370970A权利要求书1/1页1.一种重组大肠杆菌，其特征在于，其导入了吩嗪-1-羧酸合成基因。2.根据权利要求1所述重组大肠杆菌，其特征在于，所述吩嗪-1-羧酸合成基因来自于假单胞菌，其核苷酸序列如SEQIDNo:1或SEQIDNo:2所示。3.权利要求1或2任意一项所述重组大肠杆菌的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)以吩嗪-1-羧酸合成基因为模板，采用PCR扩增得到目的基因；(2)将步骤(1)得到的目的基因克隆至出发质粒上得到重组质粒；(3)将重组质粒导入宿主大肠杆菌中，即得重组大肠杆菌。4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，步骤(2)中所述出发质粒为ptrc99a质粒、pETDuet系列质粒、pACYCDuet系列质粒、pRSFDuet系列质粒、pCDFDuet系列质粒、pET系列质粒、pGEX系列质粒、pMAL系列质粒、pTXB1系列质粒或pTYB系列质粒。5.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，步骤(3)中所述宿主大肠杆菌为K12系列大肠杆菌、BL21系列大肠杆菌、Rosetta系列大肠杆菌、Origami系列大肠杆菌或Tuner系列大肠杆菌。6.权利要求1或2任意一项所述重组大肠杆菌在制备丁二酸中的应用。7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述重组大肠杆菌利用微生物电化学系统还原葡萄糖或富马酸制备丁二酸。8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述重组大肠杆菌利用微生物电化学装置制备丁二酸，具体步骤如下：(1)重组大肠杆菌活化；(2)将步骤(1)活化的重组大肠杆菌接种到发酵培养基中20～37℃培养，当OD600达到0.4-0.8时向发酵培养基中添加IPTG，20～37℃诱导培养6-14h；其中IPTG在发酵培养基中的浓度为0～1mM；(3)将步骤(2)得到的诱导培养体系接种于微生物电化学装置的阴极室中，持续向阴极室通入CO2使其保持无氧状态；在外加电压作用下，重组大肠杆菌以阴极室中的富马酸或葡萄糖为底物，催化富马酸或葡萄糖发生还原反应生成丁二酸。9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，步骤(3)中所述外加电压的范围为-0.4～-0.8Vvs.参比电极，反应温度为30～37℃，反应时间为20～48h。10.根据权利要求8-9任意一项所述的应用，其特征在于，所述微生物电化学装置包括由质子交换膜隔开的阳极室和阴极室，位于阳极室的阳极、阳极液通过电源和位于阴极室的阴极、阴极液形成闭合回路；所述阴极室还设有进气口和出气口；所述阴极室还设有参比电极，所述参比电极为Ag/AgCl电极或甘汞电极。2CN109370970A说明书1/7页一种重组大肠杆菌及其构建方法与应用技术领域[0001]本发明涉及大肠杆菌电化学合成丁二酸，具体涉及一种重组大肠杆菌及其构建方法与应用。背景技术[0002]生物电化学系统是一种生物催化剂在电极上进行氧化和/或还原反应的电化学系统，当以微生物为催化剂时就形成了微生物电化学系统(MicrobialElectro-Chemicalsystem,MECs)。微生物电化学系统是近年来在微生物电化学技术基础上所构建，是综合了生物学、化学、物理学、电磁学等多个学科的综合学科工艺体系，并逐步成为了现代能源和环境领域研究的焦点。[0003]在生物电化学系统中，微生物电合成是近年来发展起