一种重组大肠杆菌及其构建方法.pdf

(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN115960806A(43)申请公布日2023.04.14(21)申请号202211481758.2C12N15/70(2006.01)(22)申请日2022.11.24C12N15/53(2006.01)C12N15/54(2006.01)(83)生物保藏信息C12N15/60(2006.01)CGMCCNO.260022022.10.31C12P7/46(2006.01)CGMCCNO.260042022.10.31C12R1/19(2006.01)CGMCCNO.260052022.10.31(71)申请人苏州聚维元创生物科技有限公司地址215000江苏省苏州市高新区金枫路169号(72)发明人姜睿康薛怡芸李承张天元(74)专利代理机构天津市君砚知识产权代理有限公司12239专利代理师何德俊(51)Int.Cl.权利要求书2页说明书7页C12N1/21(2006.01)序列表（电子公布）附图2页(54)发明名称一种重组大肠杆菌及其构建方法(57)摘要本发明公开了一种重组大肠杆菌及其构建方法，所述重组大肠杆菌包含有基因重组质粒，所述基因重组质粒为pJUN‑galp‑glk、pACYC‑cgmdh‑ppc或pRSF‑pck中的一种或多种。本发明的pACYC‑cgmdh‑ppc和pRSF‑pck质粒通过过表达大肠杆菌来源的ppc基因和pck基因，强化了PEP向草酰乙酸(OAA)的代谢；同时过表达了谷氨酸棒杆菌来源的mdh基因，使得OAA向苹果酸(MAL)的转化得到增强。这一系列操作使得逆TCA循环得到了强化。pJUN‑galp‑glk质粒引入外源葡萄糖转运系统，这种转运系统不消耗PEP，提高了丁二酸的产率。CN115960806ACN115960806A权利要求书1/2页1.一种重组大肠杆菌，其特征在于，所述重组大肠杆菌包含有基因重组质粒，所述基因重组质粒为pJUN‑galp‑glk、pACYC‑cgmdh‑ppc或pRSF‑pck中的一种或多种，所述pJUN‑galp‑glk、pACYC‑cgmdh‑ppc或pRSF‑pck的基因序列如Seq.IDNo1‑3所示。2.如权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述重组质粒为pACYC‑cgmdh‑ppc，所述重组大肠杆菌的保藏号为CGMCCNO.26002，保存地点为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保存时间为2022年10月31日；所述重组质粒为pJUN‑galp‑glk，所述重组大肠杆菌的保藏号为CGMCCNO.26004，保存地点为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保存时间为2022年10月31日；所述重组质粒为pRSF‑pck，所述重组大肠杆菌的保藏号为CGMCCNO.26005，保存地点为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保存时间为2022年10月31日。3.如权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于，通过以下方法构建：步骤1，构建基因重组质粒；步骤2，将步骤1构建得到的基因重组质粒通过化学转化的方法转入大肠杆菌中，得到所述重组大肠杆菌，将所述重组大肠杆菌的菌株保藏备用。4.如权利要求3所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述重组质粒通过以下方法构建：基于pRSF‑Duet1质粒，使用gibson组装，将来源于谷棒杆菌的cgmdh基因连接至所述pRSF‑Duet1质粒中，构成pACYC‑cgmdh‑ppc质粒；基于pACYC‑Duet‑1质粒，使用gibson组装，将来源于大肠杆菌的pck基因连接至所述pRSF‑Duet1质粒中，构成pRSF‑pck质粒；基于pJUN‑C5质粒，使用gibson组装，将来源于源于大肠杆菌的galp和glk基因连接至所述pRSF‑Duet1质粒中，构成pJUN‑galp‑glk质粒。5.如权利要求4所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述pRSF‑pck质粒通过以下方法构建：设计pck的正反向引物，结合质粒骨架，设计同源臂的引物pRSF‑F/R，PCR后胶回收，测量浓度后使用GIBSON连接，涂Kan板后挑取克隆验证，并使用T7正反向引物测序，验证正确后得到pRSF‑PCK；pJUN‑galp‑glk质粒通过以下方法构建：使用无缝克隆将galp连接至pJUN‑C5载体上，galp使用组成型启动子PUTR‑infc‑rplT表达，将glk连接至pJUN‑benM上，使用组成型启动子PL1986表达，之后将glk和启动子PL1986一起作为片段p下来连接至pJUN‑benM‑galp上得到pJUN‑galp‑glk质粒；所述pACYC‑cgmdh‑ppc质粒通过以下方法构建：先将ppc片段连接至pACYC‑Duet‑1的第二个启动子后，之后线性化载体，