一种用于猪胰岛细胞的冻存复苏方法及冻存液和复苏液.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN109892319A(43)申请公布日2019.06.18(21)申请号201910193670.2(22)申请日2019.03.14(71)申请人湖南赛诺生物科技股份有限公司地址410600湖南省长沙市宁乡县金洲新区金水东路128号(72)发明人王维王佳谷星石李桑徐畅(74)专利代理机构长沙市融智专利事务所(普通合伙)43114代理人袁靖(51)Int.Cl.A01N1/02(2006.01)C12N5/071(2010.01)权利要求书2页说明书7页附图5页(54)发明名称一种用于猪胰岛细胞的冻存复苏方法及冻存液和复苏液(57)摘要本发明公开了一种用于猪胰岛细胞的冻存复苏方法及冻存液和复苏液。本方法是在冻存前，使用海藻酸钠包裹猪胰岛细胞，在不影响正常代谢水平的前提下，构成相对稳定三维附着空间，使其在冻存-复苏过程后保障稳定的回收率(>60％)和胰岛素分泌功能，以达到建立胰岛细胞库的目的。CN109892319ACN109892319A权利要求书1/2页1.一种猪胰岛细胞的冻存-复苏方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)制备胰岛细胞团微胶囊；(2)采用冻存液对胰岛细胞团微胶囊进行冻存，所述的冻存液包括A液、B液，组成如下：A液为低浓度冻存液，含二甲基亚砜0.5-1.5M，乙二醇0.1-1M，过氧化氢酶10-100μg/mL，海藻糖0.1-1M，β.氨基乙磺酸1-10mM，猪血清30-80％体积百分比；B液为高浓度冻存液，含二甲基亚砜2.5-4.5M，乙二醇0.1-1M，过氧化氢酶10-100μg/mL，海藻糖0.1-1M，β-氨基乙磺酸1-10mM，猪血清30％-80％体积百分比；(3)采用复苏液对冻存的胰岛细胞团微胶囊进行复苏，所述的复苏液包括C液、D液，组成如下：C液为复苏平衡液，含蔗糖0.75-1.50M，过氧化氢酶10-100μg/mL，β-氨基乙磺酸1-10mM，SD2820.1-5mM，5-30％体积百分比人血白蛋白；D液为倍比稀释液，含过氧化氢酶10-100μg/mL，β-氨基乙磺酸1-10mM，SD2820.1-3mM，人血白蛋白5-30％体积百分比，乳酸醛酸盐10-100mM。2.根据权利要求1所述的猪胰岛细胞的冻存-复苏方法，其特征在于，步骤(2)包括：将步骤(1)制备的胰岛细胞团微胶囊静置沉淀，弃上清；向弃尽上清的胰岛细胞团微胶囊中加入A液后平衡，再加入B液平衡；将胰岛细胞团微胶囊分装至冻存管中；分阶段降温后将细胞置于液氮中长期保存。3.根据权利要求2所述的猪胰岛细胞的冻存-复苏方法，其特征在于，步骤(2)具体如下：1)将步骤(1)制备的胰岛细胞团微胶囊静置沉淀，弃上清；2)向弃尽上清的胰岛细胞团微胶囊中加入A液，置于0～10℃，优选4℃平衡至少30分钟；3)加入等体积B液，混匀后置于-20～4℃，优选0℃平衡至少20分钟；4)将胰岛细胞团微胶囊按5000-10000IEQ/mL的量分装至预冷的冻存管中；5)以1～5℃/min，优选1℃/min的降温速率，将温度降至-10～0℃，优选-7.5℃，平衡至少10分钟；6)以0.2～1℃/min，优选0.2℃/min的降温速率，将温度降至-60～-20℃，优选-40℃，后将细胞置于液氮中长期保存。4.根据权利要求1所述的猪胰岛细胞的冻存-复苏方法，其特征在于，步骤(3)包括37℃快速溶解胰岛细胞团微胶囊，静置沉淀，弃冻存液上清；添加复苏平衡液C液平衡；再加入倍比稀释液D液平衡；静置沉淀，弃上清，加培养基培养。5.根据权利要求4所述的猪胰岛细胞的冻存-复苏方法，其特征在于，步骤(3)具体如下：1)37℃快速溶解胰岛细胞团微胶囊，静置沉淀，弃冻存液；2)添加1-5倍体积复苏平衡液C液，4℃平衡至少30分钟；3)加入等体积倍比稀释液D液，4℃平衡至少10分钟，4)步骤3)最少重复3次；5)静置沉淀，弃上清，加培养基培养。6.根据权利要求1所述的猪胰岛细胞的冻存-复苏方法，其特征在于，步骤(1)制备胰岛细胞团微胶囊的壁材包括天然材料、半合成材料或合成材料；天然材料包括：琼脂糖、神经2CN109892319A权利要求书2/2页鞘髓磷脂、海藻酸盐、壳聚糖、明胶、纤维蛋白中的一种或几种；半合成材料包括：羧甲基纤维素钠、醋酸纤维素中的一种或几种；合成材料包括：乳酸乙醇酸共聚物、聚氨基酸、聚甲基丙烯酸甲酯、聚氯乙烯中的一种或几种。7.根据权利要求1或6所述的猪胰岛细胞的冻存-复苏方法，其特征在于，步骤(1)采用海藻酸钠和氯化钙制备胰岛细胞团微胶囊，优选具体包括如下步骤：1)将胰岛细胞团和海藻酸钠溶液混合制备微胶囊，混合液中胰岛细胞团浓度为5000-10000IEQ/mL，海藻酸钠浓度为0.5-10％；