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细胞冻存和复苏
细胞低温冷冻贮存是细胞室的常规工作。细胞冻存与细胞传代保存相比可以减少人力、经费，减少污染，减少细胞生物学特性变化。
冻存和复苏的原则
冻存细胞的理论基础
当细胞冷到零度以下，可以产生以下变化：细胞器脱水，细胞中可溶性物质浓度升高，并在细胞内形成冰晶。
如果缓慢冷冻，可使细胞逐步脱水，细胞内不致产生大的冰晶；相反．结晶就大，大结晶会造成细胞膜、细胞器的损伤和破裂。复苏过程应快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重结晶。

细胞冻存方法
预先配制冻存液：20%血清培养基
10%DMSO（二甲基亚砜）
取对数生长期细胞1ml于冻存管中，经胰酶消化后，加入适量冻存液，用吸管吹打制成细胞悬液（1×106—5×106细胞/ml)，密封后标记冷冻细胞名称和冷冻日期。
慢冻程序
标准程序（放哪里？）
当温度在-25℃以上时，1-2℃/min
当温度达-25℃以下时，5-10℃/min
当温度达-100℃时，可迅速放入液氮中
简易程序
将冻存管于4℃放置1小时，于-20℃放置1小时，通过线绳将装有冷冻管的纱布袋固定于液氮罐罐口（-70℃），放置1小时，后直接投入液氮中（-196℃）
细胞复苏方法
从液氮中取出冻存管，迅速投入37℃水浴中，使其融化（1分钟左右）
注意防护（冻存管爆炸）！
5分钟内用培养液稀释至原体积的10倍以上
低速离心10分钟
去上清，加新鲜培养液培养刚复苏的细胞
低温保护剂的应用
在细胞冻存时加入温保护剂，能大大提高冻存效果。
常用的低温保护剂是DMSO，它是一种渗透性保护剂，可迅速透入细胞，提高胞膜对水的通透性，降低冰点，延缓冻结过程，能使细胞内水分在冻结前透出细胞外，在胞外形成冰晶，减少胞内冰晶，从而减少冰晶对细胞的损伤。

注意事项：

在使用DMSO前，不要对其进行高压灭菌，因其本身就有灭菌作用。高压灭菌反而会破坏其分子结构，以致降低冷冻保护效果。在常温下，DMSO对人体有毒，故在配制时最好带手套。
在将细胞冻存管投入液氮时，动作要小心、轻巧，以免液氮从液氮罐内溅出。若液氮溅出，可能对皮肤造成冻伤。操作过程中最好带防冻手套、面罩、工作衣或防冻鞋。
应注意控制冻存细胞的质量。既要在冻存前保障细胞具有高活力，还要确保无微生物污染，这样的细胞才具有冻存价值。另外，在每批细胞冻存一段时间后，要复苏1～2管，以观察其活力以及是否受到微生物的污染。
冻存管宜采用塑料冻存管，不宜使用玻璃安瓿。因为在复苏时，需要从-196℃的液氮中取出冻存管，立即投入37℃温水中，温差很大，玻璃安瓿瓶容易爆炸而发生危险。

污染的类型
细胞培养过程中的污染不仅仅指微生物，而且还包括所有混入培养环境中的、对细胞生存有害或造成细胞不纯的物质，包括生物（真菌、细菌、病毒和支原体）、化学物质和细胞（非同一种的其他细胞）。
微生物污染的途径
空气：微生物传播的最主要途径。
器材：清洗消毒不彻底。
操作：无菌观念不强，操作不规范。
血清：支原体或病毒污染。
组织样本：造成原代培养污染。
微生物污染对细胞的影响
体外培养细胞自身没有抵抗污染的能力；
培养基中加入的抗生素的抗污染能力有限；
培养细胞一旦发生污染，多数将无法挽救；
污染早期或污染程度较轻时，及时处理，部分细胞有可能恢复。
污染物持续存在对细胞的影响：
轻者细胞生长缓慢，分裂相对减少，细胞变得粗糙，轮廓增强，胞质中出现较多的颗粒状物质；
重者细胞增殖停止，分裂相消失，胞质中出现大量的堆积物，细胞变圆或崩解，从瓶壁脱落。
微生物污染的检测
真菌污染
真菌污染是细胞培养过程中最常见的一种，尤其在霉雨季节进行细胞培养更易污染。最常见的真菌有烟曲霉、黑曲菌、孢子霉、毛霉菌、白色念珠菌和酵母菌等。培养细胞受真菌污染后，可见培养液中漂浮着白色或浅黄色的小点，有的散在生长，培养液一般不发生混浊；倒置显微镜下可见丝状、管状或树枝状的菌丝纵横交错在细胞之间或培养基中，有的呈链状排列。念珠菌和酵母菌呈卵圆形散在细胞周边和细胞之间。个体细小，有增多趋势。镜下看时，要将培养瓶用酒精棉球擦干净，以防止与瓶外尤其瓶底外面生长的菌丝相混淆。真菌污染后，细胞生长变慢，但最后由于营养耗尽及毒性作用而使细胞脱落死亡。
细菌污染
细菌污染是实验室细胞培养中常见的污染，即使在细胞培养液中加入了抗菌素(一般为预防剂量)，也可能因为操作不慎而引起污染。最常见的有革兰氏阳性菌，如枯草杆菌以及大肠杆菌、假单胞菌等革兰氏阴性菌，其中又以白色葡萄球菌较常见。培养细胞受细菌污染后，会出现培养液变混浊，pH改变。也有的培养液肉眼观察无多少改变，只能在镜下发现菌体才知污染。所以，每天应仔细观察。污染后细胞发生病理改变，胞内颗粒增多、增粗，最后变圆脱落死亡，造成试验失败和细胞株(系)丢失。
支原体污染
支原体是介于细菌与