汗腺样细胞冻存复苏液及保持细胞活性的冻存复苏方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号(10)申请公布号CNCN103798224103798224A(43)申请公布日2014.05.21(21)申请号201210436501.5(22)申请日2012.11.05(71)申请人中国人民解放军总医院第一附属医院地址100048北京市海淀区阜成路51号(72)发明人付小兵马奎黄沙盛志勇(74)专利代理机构北京北新智诚知识产权代理有限公司11100代理人王淳(51)Int.Cl.A01N1/02(2006.01)C12N5/071(2010.01)权权利要求书2页利要求书2页说明书5页说明书5页附图1页附图1页(54)发明名称汗腺样细胞冻存复苏液及保持细胞活性的冻存复苏方法(57)摘要本发明提供一种汗腺样细胞的冻存液及复苏液，其是在血清替代物中添加以下组分配制而成：人表皮生长因子，浓度为50-100ng/mL；重组人角质细胞生长因子-Ⅱ，浓度为10-100ng/mL；三碘甲状腺原氨酸，浓度为10-50ng/mL；半琥珀酸氢化可的松，浓度为0.5-1μg/mL；胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠，浓度为0.01-0.2mL/mL；牛血清白蛋白，浓度为0.01-1g/mL。本发明还提供了一种利用该冻存液和复苏液的细胞冻存复苏方法，与传统冻存复苏方法相比，采用本发明提供的方法，冻存复苏存活率高，不影响汗腺样细胞的特性，也不会改变其汗腺样细胞分化状态，解决了汗腺样细胞储存复苏困难的问题。CN103798224ACN10379824ACN103798224A权利要求书1/2页1.一种汗腺样细胞冻存液，其特征在于，其是在血清替代物中添加以下组分配制而成：人表皮生长因子，浓度为50-100ng/mL；重组人角质细胞生长因子-Ⅱ，浓度为10-100ng/mL；三碘甲状腺原氨酸，浓度为10-50ng/mL；半琥珀酸氢化可的松，浓度为0.5-1μg/mL；胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠，浓度为0.01-0.2mL/mL；牛血清白蛋白，浓度为0.01-1g/mL。2.如权利要求1所述的冻存液，其特征在于，所述人表皮生长因子的浓度为60-90ng/mL；所述重组人角质细胞生长因子-Ⅱ的浓度为20-60ng/mL；所述三碘甲状腺原氨酸的浓度为20-40ng/mL；所述半琥珀酸氢化可的松的浓度为0.6-0.9μg/mL；所述胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠的浓度为0.03-0.15mL/mL；所述牛血清白蛋白的浓度为0.1-0.8g/mL。3.如权利要求1所述的冻存液，其特征在于，所述人表皮生长因子的浓度为70-80ng/mL；所述重组人角质细胞生长因子-Ⅱ的浓度为30-50ng/mL；所述三碘甲状腺原氨酸的浓度为25-30ng/mL；所述半琥珀酸氢化可的松的浓度为0.7-0.8μg/mL；所述胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠的浓度为0.05-0.1mL/mL；所述牛血清白蛋白的浓度为0.3-0.6g/mL。4.如权利要求1-3中任一项所述的冻存液，其特征在于，所述血清替代物为Knock-out血清替代物。5.一种汗腺样细胞复苏液，其特征在于，其是在血清替代物中添加以下组分配制而成：人表皮生长因子，浓度为50-100ng/mL；重组人角质细胞生长因子-Ⅱ，浓度为10-100ng/mL；三碘甲状腺原氨酸，浓度为10-50ng/mL；半琥珀酸氢化可的松，浓度为0.5-1μg/mL；胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠，浓度为0.01-0.2mL/mL；牛血清白蛋白，浓度为0.01-1g/mL。6.如权利要求5所述的复苏液，其特征在于，所述人表皮生长因子的浓度为60-90ng/mL；所述重组人角质细胞生长因子-Ⅱ的浓度为20-60ng/mL；所述三碘甲状腺原氨酸的浓度为20-40ng/mL；所述半琥珀酸氢化可的松的浓度为0.6-0.9μg/mL；所述胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠的浓度为0.03-0.15mL/mL；所述牛血清白蛋白的浓度为0.1-0.8g/mL。2CN103798224A权利要求书2/2页7.如权利要求5所述的复苏液，其特征在于，所述人表皮生长因子的浓度为70-80ng/mL；所述重组人角质细胞生长因子-Ⅱ的浓度为30-50ng/mL；所述三碘甲状腺原氨酸的浓度为25-30ng/mL；所述半琥珀酸氢化可的松的浓度为0.7-0.8μg/mL；所述胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠的浓度为0.05-0.1mL/mL；所述牛血清白蛋白的浓度为0.3-0.6g/mL。8.如权利要求5-7中任一项所述的复苏液，其特征在于，所述血清替代物为Knock-out血清替代物。9.一种保持细胞活性的冻存方法，其特征在于，将待冻存的细胞消化收集离心后，加入如权利要求1-3中任一项所述的冻存液，令细胞浓度为0.5-2×106/m