一种提高猪胰岛素纯度和收率的分离纯化方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN110922472A(43)申请公布日2020.03.27(21)申请号201811098673.XC07K1/30(2006.01)(22)申请日2018.09.20C07K1/20(2006.01)C07K1/34(2006.01)(71)申请人泰州医药城国科化物生物医药科技有限公司地址225316江苏省泰州市药城大道一号（创业路东侧、园南路北侧）新药创制基地二期D幢大厦704室(72)发明人梁鑫淼叶贤龙郭志谋王超然肖思佳于伟丁晨辉(74)专利代理机构上海邦德专利代理事务所(普通合伙)31312代理人余昌昊(51)Int.Cl.C07K14/625(2006.01)C07K1/36(2006.01)权利要求书2页说明书6页附图3页(54)发明名称一种提高猪胰岛素纯度和收率的分离纯化方法(57)摘要本发明提出一种提高猪胰岛素纯度和收率的分离纯化方法，本方法利用高压色谱系统对猪胰岛素粗样进行分离提纯，使用反相色谱材料为固定相，洗脱的流动相为含有至少一种可与水混溶的有机溶剂和至少一种缓冲盐物质、pH值为3.5-4.5，本发明所述的色谱纯化方法可以一步将粗样品中相关蛋白质杂质含量从8.0％降低0.6％、A21脱酰胺胰岛素含量从4.0％降低至0.5％和高分子杂质含量从4.5％降低至0.1％以下，回收率高达95％。该色谱不但具有高载样量和回收率等优势，且操作过程简单，重复性高，易于规模化生产，经济成本较低。CN110922472ACN110922472A权利要求书1/2页1.一种提高猪胰岛素纯度和收率的分离纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1：猪胰岛素的提取，包括以下步骤：1.1：提取新鲜的猪胰组织并搅碎；1.2：将搅碎的所述猪胰组织通过提取液提取两次或两次以上，以得到浸出液；1.3：对所述浸出液进行去除杂蛋白和脂肪的处理，以得到澄清的浓缩液；1.4：调节所述澄清的浓缩液的pH，向所述浓缩液内加入精盐，静置沉淀；1.5：过滤出所述浓缩液内沉淀物，将所述沉淀物进行除脂肪和脱水处理；1.6：将所述沉淀物真空干燥得到初提取物；步骤2：猪胰岛素的粗纯化，包括以下步骤：2.1：通过酸水溶解所述初提取物；2.2：分离出所述酸水中的胰岛素沉淀；2.3：将所述胰岛素沉淀溶解于酸中，以形成混合溶液；2.4：对所述混合溶液进行结晶；2.5：提取结晶物进行洗涤和真空干燥处理，得到猪胰岛素粗品；步骤3：猪胰岛素的精细纯化，包括以下步骤：3.1：将所述猪胰岛素粗品完全溶解于pH＝3.5-4.5的醋酸铵缓冲溶液中；3.2：通过pH＝3.5-4.550-250mM醋酸铵缓冲溶液平衡反相色谱柱；3.3：将步骤3.1中所述醋酸铵缓冲溶液过滤后上样至平衡好的所述反相色谱柱，进行处理；3.4：通过线性梯度增加有机溶剂浓度的方式纯化目标蛋白，以得到目标蛋白馏分；步骤4：对所述目标蛋白馏分依次进行除盐、除有机溶剂处理、离心和取沉淀干燥的处理，得到胰岛素纯品粉末。2.根据权利要求1所述的提高猪胰岛素纯度和收率的分离纯化方法，其特征在于，在步骤1.2中，所述提取液为酸性乙醇溶液；在步骤1.3中，对所述浸出液进行去除杂蛋白和脂肪的处理包括:向所述浸出液内添加氨水，使pH达到8.0-8.8后，将所述浸出液过滤得到滤液，向所述滤液中添加硫酸调节pH至2.5-3.0；在0℃的情况下放置使酸性杂蛋白沉淀，分取清液，将所述清液进行真空浓缩，使浓缩液浓缩至原体积到1/7-1/9，将所述浓缩液在10min内迅速加温至50℃立即用冰冷却至0℃，放置3h，将上层脂肪分离；在步骤1.4中，调节所述澄清的浓缩液的pH达2.0-3.0，在20-25℃下搅拌加入所述澄清的浓缩液容积25％的精盐；在步骤1.5中，所述沉淀物通过污水丙酮的洗涤进行除脂肪和脱水处理。3.根据权利要求1所述的提高猪胰岛素纯度和收率的分离纯化方法，其特征在于，在步骤2.2中，分离出所述酸水中的胰岛素沉淀包括，向酸水中加入冷丙酮、通过氨水调节pH至4.0-4.2，再加入冷丙酮，静置沉淀后过滤取滤液；滤液通过氨水调节pH至4.0-4.2，加入氯化锌，静置沉淀后抽滤，合并两次沉淀得到胰岛素粗纯品。4.根据权利要求1所述的提高猪胰岛素纯度和收率的分离纯化方法，其特征在于，在步骤2.3中，每克所述胰岛素沉淀用50-60ml20％枸椽酸溶解。5.根据权利要求1所述的提高猪胰岛素纯度和收率的分离纯化方法，其特征在于，在步骤2.4中，向所述混合溶液中加入固体氯化锌和丙酮，搅拌均匀后，调节pH至6.0-6.2，0℃情况下析出结晶。2CN110922472A权利要求书2/2页6.根据权利要求1所述的提高猪胰岛素纯度和收率的分离纯化方法，其特征在于，在步骤2.5中，通过丙酮