一种高纯度猪脂肪祖细胞的分离纯化方法.pdf

(19)国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN114990056A(43)申请公布日2022.09.02(21)申请号202210695711.X(22)申请日2022.06.20(71)申请人南京周子未来食品科技有限公司地址211225江苏省南京市溧水区白马镇白朱路111号申请人南京农业大学(72)发明人周光宏宋文娟丁世杰李惠侠唐长波刘裴裴(74)专利代理机构南京天华专利代理有限责任公司32218专利代理师徐冬涛(51)Int.Cl.C12N5/077(2010.01)权利要求书2页说明书8页附图7页(54)发明名称一种高纯度猪脂肪祖细胞的分离纯化方法(57)摘要本发明提供一种高纯度猪脂肪祖细胞的分离纯化方法，包括如下步骤：采集猪脂肪组织，漂洗，消化，得到含有猪脂肪祖细胞的单核细胞悬液；取含有脂肪祖细胞的单核细胞悬液，离心、细胞筛过滤、裂解、贴壁培养，取贴壁细胞即为含有猪脂肪祖细胞的单核细胞群；将猪脂肪祖细胞的单核细胞群进行流式分选，先选取出CD31和CD45阴性的细胞，再从前述细胞中选取出CD29和CD140a阳性的细胞，即为纯化后的猪脂肪祖细胞。应用本发明的纯化方法，可以稳定的获得高纯度的猪脂肪祖细胞。分离得到的猪脂肪祖细胞具有高效的分化效率。应用本发明的方法，可以为培养脂肪研究和实际生产提供大量的种子细胞来源。CN114990056ACN114990056A权利要求书1/2页1.一种猪脂肪祖细胞的纯化方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：(1)分离待纯化细胞样品：采集猪脂肪组织，漂洗，消化，得到含有猪脂肪祖细胞的单核细胞悬液；(2)初步纯化：取含有猪脂肪祖细胞的单核细胞悬液，离心、细胞筛过滤、裂解、贴壁培养，取贴壁细胞即为含有猪脂肪祖细胞的单核细胞群；(3)流式分选纯化：将步骤(2)得到的猪脂肪祖细胞的单核细胞群进行流式分选，所述流式分选的抗体为CD140a、CD29、CD31、CD45，先选取出CD31和CD45阴性的细胞，再从前述细胞中选取出CD29和CD140a阳性的细胞，即为纯化后的猪脂肪祖细胞。2.根据权利要求1所述的猪脂肪祖细胞的纯化方法，其特征在于，步骤(1)中，所述猪脂肪组织为1～10日龄内仔猪皮下脂肪组织。3.根据权利要求1所述的猪脂肪祖细胞的纯化方法，其特征在于，步骤(1)中，所述漂洗为采用酒精和/或含青霉素‑链霉素双抗的PBS漂洗；优选的，所述酒精为75％酒精溶液，所述含青霉素‑链霉素双抗的PBS为含3％的青霉素‑链霉素双抗的PBS；优选的，酒精漂洗时间为10～30s，含青霉素‑链霉素双抗的PBS漂洗时间为10～60s。4.根据权利要求1所述的猪脂肪祖细胞的纯化方法，其特征在于，步骤(1)中，所述消化为将漂洗后的猪脂肪组织切碎，置于消化液中，使切碎的猪脂肪组织与消化液体积比为1:1～5:1，所述消化液为含0.5～5％Ⅰ型胶原酶和3vol％青霉素‑链霉素双抗的1％牛血清白蛋白溶液，消化结束后，加入含10vol％胎牛血清和1vol％青霉素‑链霉素双抗的DMEM/F12的培养基终止消化，得到含有猪脂肪祖细胞的单核细胞悬液；优选的，消化时间为30～150min；优选的，消化温度为37℃；优选的，所述消化在30rpm～120rpm的转速震荡下操作；优选的，所述含有猪脂肪祖细胞的单核细胞悬液可顺利通过10～50mL注射器针头；进一步优选的，所述含有猪脂肪祖细胞的单核细胞悬液可顺利通过30mL注射器针头。5.根据权利要求1所述的猪脂肪祖细胞的纯化方法，其特征在于，步骤(2)中，所述离心为在80～1000g转速下离心3～15min，去除上层的成熟脂肪细胞，得到去除成熟脂肪细胞的含脂肪祖细胞的单细胞悬液；优选的，采用100～200g离心5～10min。6.根据权利要求1所述的猪脂肪祖细胞的纯化方法，其特征在于，步骤(2)中，所述细胞筛过滤为将去除成熟脂肪细胞的含脂肪祖细胞的单细胞悬液经过60～200目的细胞筛过滤，得到去除成熟脂肪细胞和大组织块的含脂肪祖细胞的单细胞悬液；优选的，所述细胞筛过滤为将去除成熟脂肪细胞的含脂肪祖细胞的单细胞悬液依次经过200、70目的细胞筛过滤。7.根据权利要求1所述的猪脂肪祖细胞的纯化方法，其特征在于，步骤(2)中，所述裂解为将去除成熟脂肪细胞和大组织块的含脂肪祖细胞的单细胞悬液离心去除上清后，用红细胞裂解液重悬，优选为，离心参数为300～500g离心5～10min，用红细胞裂解液重悬；室温裂解5～20min，优选为10～15min，加10倍体积PBS终止裂解后，300～500g离心5～10min，弃上清，得到去除红细胞、成熟脂肪细胞和大组织块的含脂肪祖细胞的单细胞悬液。8.根据权利要求1所述的猪脂肪祖细胞的纯化方法，其特征在于，步骤(2)中，所述贴壁2CN1149