一种β-烟酰胺核糖二核苷酸的制备方法.pdf

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号CN111635917A(43)申请公布日2020.09.08(21)申请号202010529554.6(22)申请日2020.06.11(71)申请人辽宁天华生物药业有限公司地址123000辽宁省阜新市海州区创业路化工街1号(72)发明人王杰颜祥飞彭文静李卓王姝昕宋辉冯晓燕(74)专利代理机构沈阳亚泰专利商标代理有限公司21107代理人马维骏(51)Int.Cl.C12P19/36(2006.01)C12N1/20(2006.01)C12N9/12(2006.01)C12R1/19(2006.01)权利要求书1页说明书5页(54)发明名称一种β-烟酰胺核糖二核苷酸的制备方法(57)摘要本发明涉及生物酶催化制备领域，具体涉及一种β-烟酰胺核糖二核苷酸的制备方法。该方法首先通过高密度发酵法制备烟酰胺核糖激酶和烟酰胺单核苷酸转移酶，然后烟酰胺核糖和ATP在烟酰胺核糖激酶和烟酰胺单核苷酸转移酶作用下生产β-烟酰胺核糖二核苷酸。本发明提供制备烟酰胺核糖激酶和烟酰胺单核苷酸转移酶的高密度发酵方法，方法中使用发酵培养基中含有适合大肠杆菌生长的必需元素，在诱导剂IPTG的作用下，使得大肠杆菌在发酵培养基中良好生长并且能够高产烟酰胺核糖激酶和烟酰胺单核苷酸转移酶，酶活比较高。本发明提供β-烟酰胺核糖二核苷酸的制备方法效率高，操作简单，收率高，使用的烟酰胺核糖和ATP是常见的原料，成本低，适合产业化生产。CN111635917ACN111635917A权利要求书1/1页1.一种β-烟酰胺核糖二核苷酸的制备方法，其特征在于，具体包括以下步骤：步骤一、将大肠杆菌接种到LB的固体培养基在37℃的条件下培养12～18h，得到含有大肠杆菌的固体斜面；步骤二、将含有大肠杆菌的斜面接种量接入经过灭菌的种子液中，在温度为37℃，摇床转速为180～200r/min的条件下，培养至OD600为3.2时，摇瓶种子液长好；步骤三、通过高密度发酵法制备烟酰胺核糖激酶和烟酰胺单核苷酸转移酶，发酵培养基是由以下质量百分比的原料组成：蛋白胨1.0-2.0%，酵母浸粉0.2-1.0%，磷酸二氢钾0.05-0.15%，磷酸氢二钾0.03-0.10%，甘油0.5-1.0%，硫酸镁0.05-0.2%，消泡剂0.05-0.10%，其余是饮用水；培养基使用蒸汽灭菌后，分别接种含有烟酰胺核糖激酶和烟酰胺单核苷酸转移酶基因的大肠杆菌，温度33-37℃，通气量3-10L/min，搅拌是300-600rpm，在发酵罐里培养5-6小时加入异丙基硫代半乳糖苷IPTG0.5g诱导，继续培养15～22小时，得到培养液；步骤四、分别把步骤三中两种培养液经过离心取菌体，使用0.2-0.6MPa压力匀浆破碎后过滤取滤液，把滤液使用中空膜过滤浓缩得到酰胺核糖激酶和烟酰胺单核苷酸转移酶的酶浓缩液；步骤五、把烟酰胺核糖34g、ATP100g和8-16g氯化镁溶解到2L纯化水里，分别加入步骤四中烟酰胺核糖激酶和烟酰胺单核苷酸转移酶的酶浓缩液20-80g，温度控制在30-37℃，过程使用氢氧化钠溶液控制pH6.40-6.60之间，检测烟酰胺核糖的残留和生成的β-烟酰胺核糖二核苷酸，在酶的作用下在4小时之内烟酰胺核糖残留在0.02g/L以下，生成的β-烟酰胺核糖二核苷酸达到浓度最高。2.如权利要求1所述的β-烟酰胺核糖二核苷酸的制备方法，其特征在于，步骤三中的发酵培养基是由以下质量百分比的原料组成：蛋白胨1.0-1.5%，酵母浸粉0.5-0.8%，磷酸二氢钾0.05-0.10%，磷酸氢二钾0.05-0.08%，甘油0.5-0.8%，硫酸镁0.10-0.15%，消泡剂0.05-0.08%，其余为水。3.如权利要求1所述的β-烟酰胺核糖二核苷酸的制备方法，其特征在于，步骤五中加入氯化镁的量是10-15g。4.如权利要求1所述的β-烟酰胺核糖二核苷酸的制备方法，其特征在于，步骤五中加入烟酰胺核糖激酶和烟酰胺单核苷酸转移酶的酶浓缩液30-60g。5.如权利要求1所述的β-烟酰胺核糖二核苷酸的制备方法，其特征在于，步骤五中温度控制为35-37℃。6.如权利要求1所述的β-烟酰胺核糖二核苷酸的制备方法，其特征在于，步骤五中pH控制在6.45-6.55。2CN111635917A说明书1/5页一种β-烟酰胺核糖二核苷酸的制备方法技术领域[0001]本发明涉及生物酶催化制备领域，具体涉及一种β-烟酰胺核糖二核苷酸的制备方法。背景技术[0002]在目前所有发现的酶中，约有30-35%为氧化还原酶。在工业生物技术，特别是生物药物和精细化工行业中，氧化还原酶是重要的酶类。在氧化还原酶所催化的反应中，生成产物的同时接需要消耗一定的辅酶以进行电子和质子的转移。据统计约80%